Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Химия биологически активных веществ. Учебное пособие
.pdf
Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное государственное бюджетное
образовательное учреждение высшего образования
«Казанский национальный исследовательский
технологический университет»
Ю. В. Щербакова, А. Н. Акулов
ХИМИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Учебное пособие
Казань
Издательство КНИТУ
2018
УДК 577.11(075)
Щ61
Щербакова Ю. В.
Химия биологически активных веществ : учебное пособие /
Ю. В. Щербакова, А. Н. Акулов; Минобрнауки России, Казан. нац.
исслед. технол. ун-т. – Казань : Изд-во КНИТУ, 2018. – 84 с.
ISBN 978-5-7882-2362-9
ББК 28.072я7
Щ61
Печатается по решению редакционно-издательского совета
Казанского национального исследовательского технологического университета
Рецензенты:
канд. биол. наук, доц. А. Р. Каюмов
ст. науч. сотр., канд. хим. наук А. З. Миндубаев
Рассмотрены методы изучения биологически активных веществ и
механизмы их взаимодействия с биологическими мишенями, а также роль
активного кислорода в живых системах.
Предназначено для бакалавров, обучающихся по программе
подготовки 19.03.01 «Биотехнология», и магистров по направлению 19.04.01
«Биотехнология».
Подготовлено на кафедре промышленной биотехнологии.
ISBN 978-5-7882-2362-9 © Щербакова Ю. В., Акулов А. Н., 2018
© Казанский национальный исследовательский
технологический университет, 2018
2
УДК 577.11(075)
ББК 28.072я7
ВВЕДЕНИЕ
Современный этап развития естественных наук характеризуется
взаимопроникновением их друг в друга, обменом идей и методов
исследования. Особенно тесные контакты наблюдаются у биологии и
химии. Изучение биологических процессов на молекулярном уровне с
широким привлечением физико-химических методов исследования
способствовало резкому прогрессу в познании основ процессов
жизнедеятельности, значимая роль в которых принадлежит
биологически активным веществам.
Химия биологически активных веществ изучает строение и
биологические функции важнейших компонентов живой материи, в
первую очередь – биополимеров и низкомолекулярных биорегуляторов, уделяя основное внимание выяснению закономерностей
взаимосвязи между структурой и биологическим действием. По
существу, она является химическим фундаментом современной
биологии. Разрабатывая основополагающие проблемы химии живого
мира, химия биологически активных веществ способствует решению
задач получения практически важных препаратов для медицины,
сельского хозяйства, ряда отраслей промышленности.
В широком смысле под биологически активными веществами
понимают химические вещества, обладающие высокой физиологической активностью при небольших концентрациях по отношению к
определенным группам живых организмов или к отдельным группам их клеток. Физиологическая активность веществ может
рассматриваться как с точки зрения возможности их медицинского применения, так и с позиции поддержания нормальной
жизнедеятельности человеческого организма или придания группе
организмов особых свойств (таких, например, как повышенная
устойчивость культурных растений к болезням).
Данное пособие как раз и рассматривает методы изучения
биологически активных веществ и механизмы взаимодействия
некоторых биологически активных веществ с биологическими
мишенями, а также роль активного кислорода в живых системах.
3
1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
В ОКРУЖАЮЩЕЙ НАС СРЕДЕ
Аминокислоты [1]
Среди низкомолекулярных природных органических соедине-
ний особо важное место принадлежит аминокислотам. Они являются
производными органических карбоновых кислот, где один из атомов
водорода в углеводородном радикале кислоты замещен на аминогруппу, располагающуюся, как правило, по соседству с карбоксильной
группой, т.е. в α-положении:
Первая аминокислота была получена из сока спаржи в 1806 г.
С тех пор из растений, животных и микроорганизмов выделено свыше
150 природных аминокислот, установлено их строение и выявлены
функции многих из них. Так, например, недавно ученые открыли, что аминомасляная кислота обеспечивает процессы торможения в нервной
системе, а некоторые аминокислоты очень широко представлены в
растительном царстве. Многие аминокислоты являются предшественниками биологически активных соединений: гормонов, витаминов,
алкалоидов, антибиотиков и др.
Лабораторная работа 1
Определение в растительных экстрактах аминокислот
методом хроматографии на бумаге
Метод хроматографии на бумаге используется для разделения
смесей разнообразных органических веществ. Разделение веществ
происходит вследствие различия в распределении их между двумя
4
жидкими фазами, одна из которых подвижна, а другая – нет.
Неподвижная фаза – вода - удерживается твердым носителем
(в данном случае бумагой), не вступая с ним во взаимодействие.
Нанесенные на бумагу вещества переходят в подвижную фазу
(органический растворитель), и перемещаясь с различными
скоростями по бумажным капиллярам, разделяются. Скорость
передвижения определяется показателем Rf, представляющим
отношение величины смещения зоны вещества (X) к смещению
фронта растворителя (Xf) (Рис. 1). Для однотипных веществ при
постоянных условиях величина Rf (Rf=X/Xf) является ориентиром,
позволяющим их идентифицировать. Чем больше различие в
величинах Rf разделяемых веществ, тем лучше их разделение.
Рис. 1. Определение Rf вещества: 1 – расположение
вещества на хроматограмме
Ход работы
Экстракция. 0.5 г растительного материала помещают в колбу
на 50 мл, заливают 10 мл 70% этилового спирта и ставят на водяную
баню, разогретую до 70-80 0C, на 5 мин. Полученную вытяжку
фильтруют через бумажный фильтр в выпарительную чашку, при этом
следует стремиться, чтобы частички материала на фильтр не попадали,
поскольку далее этот материал аналогичным способом экстрагируют
еще дважды. При фильтровании после последней экстракции на
фильтр можно перенести все содержимое колбы. Выпарительную
5
чашку помещают на кипящую водяную баню и выпаривают спирт
досуха.
Хроматография. Лист хроматографической бумаги необходимого размера кладут на рабочее место, подложив снизу лист чистой
бумаги. (Размер листа хроматографической бумаги определяется
размерами имеющейся хроматографической камеры.) Отступив 2 см
от края узкой стороны, проводят простым карандашом линию старта.
Затем линию старта размечают короткими штрихами: отступив 1.5 см
от края, делают первую отметку, следующую через 2.5 см, затем через
2 см и так далее, чередуя отрезки 2.5 и 2 см. Всего 2.5 отрезков должно
быть три. На один отрезок в 2.5 см будем наносить раствор известной
аминокислоты – стандарта. Аминокислоту предварительно растворяют
на часовом стекле. Для этого на соответствующее часовое стекло
берем по 3-6 мг аминокислоты (несколько кристаллов на кончике
стеклянной палочки) и приливаем 1 мл 1% раствора HСl.
Перемешивают до растворения. На два отрезка линии старта
наносится полученный экстракт. Сухой остаток в выпарительной
чашке растворяют в 0.6 мл 1% растворе HCl, тщательно соскабливая
его со стенок кусочком резинки, наколотым на препаровальную иглу.
Подготовив исследуемый раствор и стандарты, приступаем к
нанесению. Несколько выше линии старта под хроматограмму
подкладывают линейку или пипетку, добиваясь того, чтобы линия
старта не касалась подложки. Для нанесения используем стандартные
микропипетки на 0.1 или 0.2 мл. Стандарт наносим в количестве
0.01 мл, пробу – 0.01 и 0.02 мл. Набираем в микропипетку
необходимый раствор в нужном объеме и приведя ее в
соприкосновение с началом соответствующего 2.5 см участка,
аккуратно ведем ее до конца. Скорость движения пипетки должна
быть такой, чтобы весь объем раствора распределился в 2.5 см
интервале в виде ровной полосы. После подсыхания линии старта
хроматограмму подвешивают в стакане, в который до
соответствующего уровня налита смесь растворителей, так чтобы
нижняя часть хроматограммы была погружена в смесь растворителей.
Сверху стакан закрывается другим, большим, стаканом, чтобы создать
насыщенную атмосферу паров растворителей (рис. 2).
При достижении фронтом растворителя положения около
верхнего края хроматограммы, ее вынимают и сушат в сушильном
шкафу, предварительно обозначив карандашом позицию, которой
достиг фронт растворителя.
6
Рис. 2. Устройство системы для бумажной хроматографии
Проявление хроматограммы и идентификация аминокислот.
Высушенную хроматограмму проявляют 0.25% (масс./об.) раствором
нингидрина в ацетоне, равномерно смачивая этим раствором ее
поверхность. Для этого используется кисточка из ваты или
пульверизатор. При проявлении нельзя класть хроматограмму на стол,
она должна находиться «на весу». Нельзя браться за смоченную
поверхность руками, остаются отпечатки пальцев. Пропитанную
хроматограмму помещают в сушильный шкаф на 15 мин при
70 градусах C. Аминокислоты обнаруживаются в виде синефиолетовых пятен. Пролин образует с нингидрином соединение
желтого цвета. Идентификацию аминокислот проводят по совпадению
на хроматограмме положения аминокислот пробы и аминокислотстандартов. Аминокислоты, располагающиеся на одном уровне,
являются идентичными. В разделенных парах стандартов ближними к
старту будут глу, гли, сер. Определение аминокислот можно
осуществить и по значению Rf. Для этого измеряют с точностью до
миллиметра расстояние от линии старта до линии фронта
7
растворителя (если растворитель дошел до самого верха
Аминокислота
Rf
Аланин
0,30
Аргинин
0,15
Аспарагин
0,12
Аспарагиновая кислота
0,23
Валин
0,51
Гистидин
0,11
Глицин
0,23
Глутамин
0,17
Глутаминовая кислота
0,28
Изолейцин
0,67
Лейцин
0,70
Лизин
0,12
Метионин
0,50
Пролин
0,34
Серин
0,22
Тирозин
0,45
Треонин
0,26
Триптофан
0,50
Фенилаланин
0,60
Цистеин
0,08
Цистин
0,05
хроматограммы, то это верхний край хроматограммы). С такой же
точностью измеряют расстояние от старта до центра цветового пятна
идентифицируемой аминокислоты. Отношение последнего расстояния
к первому дает значение Rf для данной аминокислоты в данном
растворителе. В справочной литературе содержатся сведения по
коэффициентам Rf для многих веществ, разделяемых в различных
системах растворителей. В настоящей работе, кроме идентификации
аминокислот пробы по стандартам необходимо определить в пробе
три аминокислоты, для которых стандарты не наносились, по Rf.
Значения Rf приведены в табл. 1.
Таблица 1. Rf для аминокислот при разделении методом
хроматографии на бумаге (смесь растворителей: н-бутанол +
уксусная кислота + вода) [2]
8
Белки и пептиды
Белки – это высокомолекулярные природные полимеры,
построенные из остатков α-аминокислот, соединенных амидной
(пептидной) связью – С(О)-NH-. Белки входят в состав всех живых
организмов. Мышцы, покровные ткани, внутренние органы, хрящи,
шерсть, кровь - все это белковые вещества. Растения синтезируют
белки из углекислого газа и воды за счет фотосинтеза. Животные
организмы получают, в основном, готовые аминокислоты с пищей и
на их базе строят белки своего организма. Практически все белки
построены из 20 α-аминокислот, принадлежащих, за исключением
глицина, к L-ряду. Пептидную или белковую молекулу формально
можно представить как продукт поликонденсации α-аминокислот,
протекающий с образованием пептидных (амидных) связей:
Определение белков электрофоретическими методами [3].
Электрофорез – это перемещение заряженных частиц в растворе
(в зависимости от знака их суммарного электрического заряда) к аноду
или катоду под действием электрического поля. Поскольку скорость
движения молекул в электрическом поле зависит от их заряда, формы
и размера, то электрофорез может быть использован для их
разделения.
Результатом проведения электрофореза является электро-
фореграмма -картина, полученная после разделения сложной смеси с
помощью электрофореза и специфического проявления. Электро-
9
фореграмма белков биологических жидкостей человека (сыворотка
крови, моча, спинномозговая жидкость и др.) позволяет врачам
получить значительную диагностическую информацию.
Например, у здорового человека относительное содержание
белковых фракций при определении их в сыворотке крови методом
электрофореза на бумаге, следующее: альбумины - 55-65%;
α1-глобулины 3-6%; α2-глобулины 7-10%; β-глобулины - 7-12%;
γ-глобулины - 13-19%.
При многих заболеваниях наблюдается изменение соотношения
фракций, тогда как общее количество белка обычно мало изменяется.
Выявление этих изменений с помощью метода электрофореза широко
используется в диагностических целях.
Электрофореграммы белков-ферментов (зимограммы) позволяют изучать изменения активности и изоферментного спектра таких
белков под действием внешних и внутренних факторов как у человека,
так и у других организмов. Получаемые данные используются в
медицине, биотехнологии, различных отраслях сельского хозяйства и
пищевой промышленности.
Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают
некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак
которого зависят в основном от рН среды. Если через этот раствор
начать пропускать электрический ток, то под действием электрического поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным
зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их
трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции.
В зависимости от величины заряда и размеров макромолекулы
приобретают разные скорости, и в этом – сущность процесса
электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из
различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул,
мигрирующих с одной и той же скоростью. Однако в жидкости нельзя
избежать конвекции, которая деформирует и смешивает разделяющиеся зоны, поэтому обычно электрофорез проводят в гелеобразной
среде. Наличие сетки геля приводит к тому, что теперь фракционируемые макромолекулы сталкиваются с нитями полимера,
образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду,
а, следовательно, снижает скорость движения молекул. Очевидно, что
препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если
средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим
с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на
10
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]