Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Химия биологически активных веществ. Учебное пособие
.pdf
электрофоретическую подвижность различных молекул и степень
разделения оказывает соотношение их линейных размеров.
Наиболее широкое применение электрофорез получил для
анализа и очистки белков и нуклеиновых кислот, хотя этот метод
может быть использован и для других заряженных биологических
молекул, таких как сахара, аминокислоты, пептиды, нуклеотиды и др.
Для фракционирования белков, нуклеиновых кислот и их фрагментов
в настоящее время используют почти исключительно гельэлектрофорез. Наиболее широко используются полиакриламидные
(ПААГ) гели и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера,
можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор.
Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул
путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в
буфер денатурирующих агентов или детергентов
Классификация электрофоретических методов.
Основными типами электрофореза являются:
- зональный электрофорез,
- изотахофорез,
- изоэлектрическое фокусирование,
- иммуноэлектрофорез.
Зональный электрофорез ведется при постоянном (не изменяющемся) значении рН буферного раствора, заполняющего данный
носитель (бумагу, гель, др.). Исследуемый образец наносится пятном
или тонким слоем на носитель, по которому и перемещается в
электрическом поле. Усложненным вариантом зонального электрофореза является диск-электрофорез (многофазный зональный
электрофорез), при котором рН и другие характеристики, постоянные
внутри одной “фазы”, при переходе к другой “фазе” скачкообразно
изменяются.
При изоэлектрическом фокусировании в среде для электрофореза создается плавный градиент рН. Белок останавливается в зоне,
где значение рН равно его изоэлектрической точке (pI). Для создания
градиента рН обычно используют раствор полиамино-поликарбоновых
кислот, которым насыщают носитель. В отсутствии электрического
поля эта смесь обычно имеет рН=6,5. При наложении электрического
поля указанные кислоты обеспечивают линейный градиент рН от 3
до 10.
В случае изотахофореза заряженные ионы сначала разделяются
в соответствии с величинами их заряда и подвижности, а затем
11
перемещаются в электрическом поле с одинаковыми и постоянными
скоростями.
Иммуноэлектрофорез сочетает в себе электрофоретическое
разделение белков с иммунопреципитацией, основанной на реакции
“антиген – антитело”. Этот тип электрофореза превосходит остальные
по чувствительности и разрешающей способности.
По цели различают:
- аналитический (для анализа состава смеси, реже – для
получения малых количеств разделяемых веществ) электрофорез;
- препаративный (для получения препаратов - значительных
количеств чистых веществ) электрофорез.
По степени денатурации разделяемых белков различают:
- нативный электрофорез;
- электрофорез в денатурирующих условиях.
В отличие от нативного электрофореза, электрофорез в
денатурирующих условиях предполагает применение химических
реагентов, разрушающих пространственную структуру разделяемых
белков.
По направлению фракционирования выделяют электрофорез,
при котором белки движутся в одном направлении, и двумерный
электрофорез, при котором сначала проводят разделение в
одном направлении, а затем – в направлении, перпендикулярном
первому.
Двумерный электрофорез позволяет резко увеличить разрешающую способность при разделении смесей, состоящих из большого
количества разных белков.
В зависимости от ориентации носителя (геля, бумаги, др.)
электрофорез может быть вертикальным или горизонтальным.
Классификация по типу носителя жидкой фазы:
- в растворе;
- на бумаге;
- в крахмальном геле;
- в геле из ацетата целлюлозы;
- в полиакриламидном геле.
Первым был разработан электрофорез без какого-либо носителя:
электрическая цепь между электродами замыкалась через буферный
раствор, в котором и происходило разделение белков. Позднее при
электрофорезе начали применять носители жидкой фазы – полимеры,
служащие “каркасом” для буфера. Применение носителей позволило
12
заметно снизить конвекцию (перемешивание) и, следовательно,
повысить качество разделения белков. Носитель может быть в форме
порошка, пленки, геля и др.
Последующие разработки были посвящены усовершенствованию свойств носителей.
Идеальный носитель должен:
а) резко снижать конвекцию;
б) быть простым в приготовлении;
в) иметь высокую теплопроводность (при низкой теплопроводности трудно охлаждать систему);
г) обладать низкой адсорбционной емкостью и химической
инертностью в отношении веществ, подвергаемых электрофорезу;
д) не иметь заряда на поверхности частиц, чтобы не вызывать
эндоэлектроосмос. Если разделяемые белки заряжены отрицательно,
то при электрофорезе они должны двигаться к аноду (+), однако
эндоэлектроосмос “тянет” их в другую сторону, к катоду (-), мешая
электрофоретическому разделению.
Гели легко принимают разные геометрические формы, поэтому
в названии электрофоретического метода с их использованием
указывают, какова конфигурация рабочего пространства. Гель для
электрофореза можно заполимеризовать:
- в трубках;
- в капиллярах;
- в пластинах (“слэбах” – от англ. slab).
Основной недостаток электрофореза в трубках – это отсутствие
теплооттока: температура в центре цилиндра геля оказывается выше,
чем у его прилегающей к стеклу поверхности. Это приводит к изгибу
белковых зон. На одну трубку наносится одна исследуемая проба.
Повысить теплоотток можно, применяя очень тонкие трубки –
капилляры. В тонких пластинах также достигается гораздо более
эффективное отведение тепла, чем в трубках. Так, при воздушном
охлаждении эффективный теплоотвод возможен при силе тока 50–
100 мА на вертикально расположенную пластину (то есть
рассеиваемая в виде тепла мощность не превышает 20 Вт). Кроме того,
конфигурация пластины позволяет в абсолютно идентичных условиях
проводить разделение сразу нескольких (10–13) проб белка. Пластины
легко сканировать и удобно разрезать. По сравнению с цилиндрическими гелями гелевые пластины позволяют значительно уменьшить
концентрацию белка в наносимой пробе.
13
Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ). Полиакрил-
амидный гель в виде поддерживающей среды при проведении
электрофореза использовал Раймонд и Вейнтрауб (S. Raymond and
L. Weintraub) в 1959 году. Теорию метода разработали Орнштейн
(Ornstein L., 1964) и Дэвис (Davis B., 1964).
Полиакриламидный гель (ПААГ) обладает многими качествами
идеального носителя (Химически инертен, можно кипятить. Можно
задать необходимый размер пор и обеспечить свойства молекулярного
сита. Высокая прозрачность. Легко готовить. Упругий, прочный.).
Имея свойства молекулярного сита, он обеспечивает электрофоретическое разделение белковых смесей не только по заряду, но и
по размеру и форме частиц. При электрофорезе в ПААГ крупные
молекулы, размеры которых соизмеримы с диаметром пор геля,
движутся медленнее, а мелкие молекулы свободно и быстро проходят
через поры геля.
Полимеризация полиакриламидного геля (рис. 3). Для получения
полиакриламидного геля используют акриламид и какой-либо агент,
образующий поперечные сшивки – обычно N,N'-метиленбисакриламид (сокращенно – бисакриламид).
Реакция полимеризации протекает по свободнорадикальному
механизму и требует наличия свободных радикалов акриламида.
В качестве инициаторов реакции полимеризации используют
вещества, разрушающиеся с образованием свободных радикалов,
которые затем взаимодействуют с молекулами акриламида и
запускают (инициируют) полимеризацию.
Наиболее широко в качестве инициатора процесса полимеризации используют персульфат аммония (NH4-SO4-SO4-NH4) (ПСА) или
калия, образующий в водном растворе за счет гомолитического разрыва связи радикалы (NH4-SO
). Рибофлавин также мо-
4
жет служить инициатором полимеризации: при освещении его водного
раствора видимым светом (445 нм) он присоединяет водород
и восстанавливается до лейкорибофлавина, который легко окисляется растворенным в воде кислородом, образуя перекись водорода. За счет разложения перекиси продуцируются гидроксильные
радикалы (НО), инициирующие цепную реакцию полимеризации
акриламида. Поскольку реакция полимеризации акриламида –
медленный процесс, то для ускорения процесса полимеризации в
качестве катализатора обычно используют N,N,N',N' – тетраметилэтилендиамин (СH3)2NCH2CH2N(CH3)2 (ТЕМЭД) – рис. 3.
14
Рис. 3. Полимеризация полиакриламидного геля
15
Для характеристики полиакриламидного геля необходимо ука-
Кoнцентрация
геля Т, %
Концентрация
бисакриламида С, %
Пределы разделения,
дальтоны
15-20
10-15
5-10
5
2-5
0,2
0,3
2-3
5
6
1 х 104 - 4 х 10
4
4 х 104 - 1 х 105
1 х 105 - 3 х 105
3 х 105 - 5 х 105
выше 5 х 105
зывать процентное содержание мономеров. Стандартно используют
следующие обозначения:
Т – процентное отношение суммарной массы обоих мономеров к
объему раствора;
С – процентное отношение массы бисакриламида к общей массе
обоих мономеров. (Т = акриламид + мономер, образующий сшивки) и
количество сшивающего агента в процентах от общего количества
мономеров (С):
Т = (a + b)/m x 100 %;
C = b/(a + b) x 100 %.
a – количество акриламида;
b – количество мономера, образующего сшивки (бисакриламида);
m – объем буфера, мл.
Т обычно варьируется в пределах 3-30%, а С – 1-5%. Выбор
значений С и Т определяется диапазоном фракционирования белков и
ограничивается механическими и адсорбционными свойствами геля
(табл. 2). Для крупнопористых гелей необходимо увеличивать степень
сшивки (повышать С до 3-5%), для мелкопористых гелей величина С
не должна превышать 1-2%.
Таблица 2. Концентрация полиакриламидных гелей, используемых
для разделения макромолекул с различными молекулярными
массами
Электрофоретическая подвижность – это скорость движения
частицы (обычно выражаемая в см/c) при напряженности
электрического поля в 1 В/см. Эта величина имеет размерность
см2×с1×В-1, а ее знак совпадает со знаком суммарного заряда
макромолекулы.
16
Рассмотрим изолированную частицу, взвешенную в идеальном
диэлектрике. Если приложить равномерное электрическое поле, то на
частицу будет действовать сила, равная произведению общего заряда
частицы на напряженность этого поля. При наложении электрического
поля скорость движения частицы (биологической макромолекулы)
довольно быстро увеличивается до тех пор, пока электрическую силу,
действующую на частицу со стороны электрического поля, не
уравновесит сила трения. После этого частица будет двигаться с
постоянной скоростью.
В случае реального электрофореза макромолекул, процесс
происходит не в диэлектрике, а в растворе электролита. При этом
вокруг заряженной частицы будет существовать ионная атмосфера.
Частица при этом будет окружена диффузным облаком ионов, заряд
которых противоположен заряду частицы. На значительных
расстояниях от частицы суммарный заряд в любом элементе объема,
достаточно большом по сравнению с атомными размерами частицы,
равен нулю. Присутствие же ионной атмосферы вокруг частицы
приводит к тому, что ее электрофоретическая подвижность
оказывается меньше, чем это предсказывается уравнением.
Это обусловливается тремя причинами.
Во-первых, потенциал на поверхности частицы снижается из-за
снижения ее эффективного электростатического заряда.
Во-вторых, электрическое поле действует также и на ионы,
окружающие макромолекулярную частицу. Поскольку знак заряда
ионного облака противоположен знаку заряда частицы, облако будет
смещаться в направлении, противоположном движению частицы,
замедляя тем самым ее миграцию (эффект электрофоретического
трения).
В-третьих, имеет место замедляющий эффект другого рода,
связанный с тем, что в электрическом поле одни ионы при
перемещении приближаются к частице, а другие удаляются от нее.
Вследствие этого в ионной атмосфере происходит непрерывное
замещение ионов, что вызывает нарушение ее сферически
симметричной формы, так как для вновь входящих ионов требуется
определенное время, чтобы найти свое место в поле макромолекулы и
прийти в равновесие с ее окружением. В результате двойной
электрический слой позади частицы растягивается. Действие
тормозящей силы такого типа носит название релаксационного
эффекта.
17
Подвижность макромолекул в полиакриламидном геле обратно
пропорциональна среднему размеру пор (формула Фергюсона):
Lg U = lg U0 – Kr Т
Kr – коэффициент задержки;
U – подвижность макромолекул в геле;
U0 – подвижность макромолекул в свободном растворе;
Т – плотность геля (концентрация мономеров)
Электрофорез в ПААГ с использованием додецилсульфата
натрия. Электрофоретическая подвижность каждого белка зависит
одновременно и от его суммарного заряда, и от молекулярной массы, и
от конфигурации и от жесткости упаковки полипептидной цепи. Вклад
каждого из этих факторов неизвестен и может существенно меняться в
зависимости от условий фореза. Для установления строгой
количественной корреляции между каким-либо одним из
перечисленных параметров и электрофоретической подвижностью
белков надо исключить влияние всех остальных.
Одним из наиболее популярных методов является электрофорез
в ПААГ с использованием додецилсульфата натрия (ДСН), который
позволяет фракционировать белки в зависимости от значения только
одного параметра – их молекулярной массы.
Основной принцип метода – снижение влияния заряда
макромолекулы на ее электрофоретическую подвижность. В этом
случае должна наблюдаться пропорциональность между молекулярной массой макромолекулы и ее сопротивлением трения
(коэффициентом задержки). Для этого белки обрабатывают избытком
ДСН, который примерно одинаково связывается с подавляющим
большинством белков в соотношении 1,4 мг ДСН с 1 мг белка.
Избыток остатков сульфокислоты делает несущественным собственный заряд белка, а постоянство соотношения детергент/белок
делает практически одинаковым отношение отрицательного заряда к
массе для любого белка.
Кроме того, при обработке белка ДСН полипептидная цепочка
распрямляется и приобретает форму жесткого эллипсоида вращения,
размер большой оси вращения которого линейно связан с числом
аминокислотных остатков, а, следовательно, с молекулярной массой
белка.
18
Электрофоретическая подвижность (u') жесткого комплекса
Т, %:
5;
10;
15.
Mr, кДа:
18-330;
10-100;
10-60.
белок-ДСН оказывается связанной с молекулярной массой белка (Mr)
простым соотношением:
u' = A – BlgMr,
где А и В – коэффициенты, зависящие от пористости геля,
температуры и других условий эксперимента.
Величину u' удобнее представлять в относительных единицах,
выражающих отношение путей миграции белка и лидирующего
красителя за время электрофореза, т.е. в значениях введенной ранее
величины Rf. Для определения коэффициентов А и В одновременно с
фракционированием исследуемой смеси необходимо провести
электрофорез набора белков-«маркеров», молекулярные массы
которых точно известны. По окончании фореза, измерив пути
миграции лидирующего красителя (бромфенолового синего) и
каждого из маркеров, можно рассчитать значения Rf и, зная
молекулярные массы маркеров, построить экспериментальную
зависимость lgMr от Rf. Если пористость геля выбрана удачно, то
такая зависимость будет линейной. Определив теперь Rf для
интересующего нас белка, из графика можно найти для него величину
lgMr и рассчитать Mr.
При данной пористости (концентрации) геля описанная выше
линейная зависимость имеет место только для белков, молекулярные
массы которых лежат в определенном интервале. Для ориентировки
можно назвать примерное значение концентрации акриламида в
зависимости от молекулярной массы белков:
Наиболее широко используемым вариантом электрофореза с
добавлением ДСН является диск-электрофорез по Лэммли [3]. Этот
метод позволяет значительно улучшить разделение фракционируемых
белков за счет введения дополнительного так называемого
«формирующего» крупнопористого геля, в котором белки не
фракционируются, а только концентрируются в виде очень узких
полос перед переходом в разделяющий гель. Система Лэммли
позволяет хорошо разделять белки с Mr = 15-200 кДа.
19
Лабораторная работа 2
Реактив
Концентрация
веществ в конечном
растворе
Навески веществ
для приготовления
раствора, 20 мл
Глицерин
25%
5 мл
ЭДТА*
0,001 М
0,076 г
ДСН 0,5 г
ДТТ**
20 мМ
61,8 мг
Трис
0,01 М
0,024 гр
Исследование полипептидного состава молока и молочных
продуктов методом электрофореза по Лэммли
Подготовка белкового образца для электрофоретических
исследований. Осаждение белка осуществляли в эпиндорфах,
добавляя захоложенный ацетон (t = -20 0С) к пробе молока или
молочного продукта в соотношении 2:1 соответственно (400 мкл
ацетона и 200 мкл молока). Эпиндорфы закрывали, встряхивали и
помещали в морозильную камеру на час (можно оставлять на
более длительное время, даже на ночь). Затем центрифугировали при
14000 об/мин в течение 10 мин. Фугат осторожно сливали, вносили в
эпиндорфы 400 мкл захоложенного ацетона, перемешивали и снова
центрифугировали. Эту операцию повторяли 4 раза, после чего осадок
белка сушили под тягой (30–40 мин). Затем белок растворяли в буфере
(табл. 3) до необходимой конечной концентрации (мг/мл). Образцы окрашивали бромфеноловым синим до появления голубоватосинего оттенка и проводили электрофоретические определения.
Полученные образцы хранили при температуре - 20 0С, не более двух
недель.
Таблица 3. Состав sample буфера
Примечание:
* этилендиаминтетрауксусная кислота;
** дитиотреитол.
Электрофорез по методу Лэммли. Сборка камеры.
На рисунках 4 и 5 представлены основные элементы для сборки
камеры
20
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]