Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Химия биологически активных веществ. Учебное пособие

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

07.09.2026

Размер:

1 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 2 3 45 / 95 6 7 8 9 > Следующая >>>

Материалы: 1) растительное масло; 2) сливочное масло;

Вид соединений

Название

Химическая формула

Радикалы

Супероксид

Гидроксильный

радикал

ОН

Синглетный

кислород

Липоперекисный

и другие перекисные

радикалы

LОО

ROO

Оксид азота

Нерадикальные

соединения

Пероксинитрит

ONOO

Перекись водорода

Н2О2

Гипохлорная кислота

HOCL

Перекиси липидов

LOOH

3) топленый жир; 4) маргарин. Реактивы: 1) хлороформ; 2) 0,001 н раствор йода в хлороформе.

Ход работы

Равные навески (0,3-0,5 г) различных жиров – растительного масла, сливочного масла, топленого жира, маргарина и др. кладут в пробирки и растворяют в одинаковых объемах (3-4 мл) хлороформа. Полученные растворы титруют 0,001 н раствором йода в хлороформе до появления розовой окраски. Сравнивают количества раствора йода, необходимого для насыщения различных жиров. Результаты опыта и его объяснение записывают, делают выводы в письменной форме.

Антиоксиданты

Одна из причин патологических процессов в организме человека, вызывающих преждевременное старение и развитие многих болезней, – избыточное накопление в организме активных форм кислорода (табл. 17) [146].

Таблица 17. Активированные метаболиты кислорода

Активные формы кислорода (АФК) включают ряд химически активных молекул – производных молекулярного кислорода, образующихся в процессе метаболизма. Следует отметить, что применительно к биологическим системам понятия «свободные радикалы» и «активные формы кислорода» не совпадают – неспаренный электрон может быть локализован на атомах углерода, серы, азота. С другой стороны, такие кислородсодержащие молекулы, как перекись водорода, синглетный кислород, гипогалоиды не являются радикалами, хотя и взаимодействуют с органическими молекулами через радикальные механизмы. Избыток АФК представляет большую опасность вследствие их способности повреждать молекулы жизненно важных биополимеров и других компонентов клетки [3, 36, 62].

Существует несколько классификаций активных форм кислорода. Однако большинство авторов придерживаются классификации согласно работам Ю.А. Владимирова [37, 38], где выделяются три категории активных форм кислорода: первичные, вторичные и третичные.

Первичные АФК образуются при окислении некоторых молекул и обладают регуляторным или антимикробным действием. К ним относятся оксид азота (NO•), обладающий сосудорасширяющим действием, и супероксид-анион (О2•-), судьба которого может быть весьма разнообразной. Обычно при помощи специализированного фермента супероксиддисмутазы он превращается в перекись водорода (Н2О2) и в дальнейшем – в гипохлорит (ClO-). Последние соединения используются макрофагами для борьбы с бактериями. При недостаточной нейтрализации супероксид-аниона его избыток, взаимодействуя с NO•, образует пероксинитрит или переводит трехвалентное железо Fe3+ в двухвалентное Fe2+, которое при взаимодействии с Н2О2, НClО и «липоперекисями» образует гидроксильный радикал ОН• или «липоксильный» радикал (LO•). Эти радикалы, как и пероксинитрит, представляют категорию вторичных радикалов, именно эта категория обладает сильным токсическим действием вследствие своей способности необратимо повреждать мембранные липиды, а также молекулы ДНК, углеводов и белков. При соединении вторичных радикалов с молекулами легко окисляющихся соединений образуются третичные радикалы.

Рассмотрим более подробно важнейшие АФК.

Супероксидный анион-радикал. Присоединение одного элект- рона к молекуле кислорода в основном состоянии приводит к

образованию супероксидного анион-радикала (О взаимодействии с протоном переходит в гидроперекисный радикал

∙

(НО

), представляющий собой слабую кислоту. Так как анион О

имеет заряд, он плохо мигрирует через мембраны, в отличие от гидроперекисного радикала НО

∙

−

. О

− более реакционноспособное

−

), который при

соединение, чем молекулярный кислород; время его жизни в биологических субстратах около 10-6 с. Будучи относительно стабильным окислителем, О

−

во многих биологических системах

может выступать в качестве донора электронов, восстанавливая ряд соединений.

Токсичность О вызывает сомнения. Протонирование О

−

в отношении клеток и микроорганизмов не

−

приводит к наработке Н2О2, а

в реакции Габера-Вейса образуется синглетный кислород и гидроксильный радикал:

−

+ Н2О2 → ОН− + ОН∙ + О

Взаимодействие О

−

с оксидом азота (NO) приводит к

образованию реакционного пероксинитрита (ОNOО). Супероксидный радикал может как окислять, так и восстанавливать ионы железа и других металлов переменной валентности:

Fe3+ + О

Fe2+ + 2Н+ + О

В физиологических условиях О

−

↔ Fe2+ + О2,

−

→ Fe3+ + Н2О.

−

индуцирует выход железа из

феррита и восстанавливает Fe3+ до Fe2+, участвуя тем самым в реакциях разложения гидроперекисей, катализируемых металлами переменной валентности. При разложении гидроперекисей образуются реакционные радикалы ОН∙ и RO∙, которые инициируют цепные процессы свободнорадикального окисления, в частности ПОЛ. Однако, обладая меньшей активностью, чем перекисные радикалы, в некоторых случаях О инактивируя радикалы RO∙ и RO

−

может даже ингибировать процессы ПОЛ,

RO∙ + О

∙

+ О

∙

[20]:

−

+ Н+ → ROH + О2,

−

+ Н+ → ROОH + О2.

−

Перекись водорода. Присоединение двух электронов к молекуле кислорода или одного электрона к аниону О образованием двухзарядного аниона О

2−

. В свободном состоянии

−

сопровождается

такой анион не существует, так как энергия связывания атомов кислорода становится отрицательной. Присоединяя протоны, он переходит в гидроперекисный анион НО

−

или Н2О2, при этом при физио-

логических значениях рН вследствие высокого рКа преобладает Н2О2.

Перекись водорода относят к окислителям средней силы, при этом, не будучи радикалом, она взаимодействует с веществами как радикальным, так и нерадикальным путем. В водных растворах в отсутствие каталазы, пероксидаз и ионов металлов переменной валентности Н2О2 относительно стабильна и, будучи электростатически нейтральной молекулой (не имеет заряда), легко проникает сквозь гидрофобные мембраны и может мигрировать сквозь клетки и ткани. Наличие нейтральных аддуктов Н2О2 обеспечивает ее проникновение внутрь клеток даже в присутствии каталазы.

Цитотоксическое действие Н2О2 in vivo может реализовываться через инактивацию ингибитора протеиназ. При действии перекиси водорода наблюдается инактивация ферментативных антиоксидантов: каталазы и глутатионпероксидазы (ГПО). Н2О2 является источником возникновения высокореакционного гидроксильного радикала, а в присутствии миелопероксидазы, пероксидазы, эозинофилов и лактопероксидазы – гипогалоидов (НОСl, HOBr, HOI, HOSCN), которые также цитотоксичны [21].

Оказалось, что скорость образования супероксид-аниона и перекиси водорода зависит от стадии развития культуры. Так, при переходе от лаг-фазы в экспоненциальную фазу образование перекиси водорода возрастает в 5-10 раз. Независимо от интенсивности образования перекиси водорода ее стационарная концентрация на всех фазах развития культуры составляла примерно одинаковую величину – 0,1-0,2 мкМ. Такое состояние достигается соответствующей величиной активности элиминирующего перекись водорода фермента – каталазы. Правда, специально модифицируя активность данного фермента, можно добиться и изменения стационарной концентрации перекиси водорода.

Рассчитанная скорость образования перекиси водорода в экспоненциально растущей культуре E. coli приближается к значению, определенному в клетках млекопитающих. Она соответствует теоретической стехиометрии 2:1 для соотношения супероксид: перекись водорода в реакции:

−

2О

+ 2ē + 4Н+ → Н2О2 + О2.

Это свидетельствует о том, что большая часть образуемой в бактериях перекиси водорода является продуктом генерации и метаболизма супероксид-аниона [17].

Пероксид водорода может вызывать значительные сдвиги в метаболизме микроорганизмов и приводить к развитию окислительного стресса. Н2О2 относится к соединениям, обладающим высокой мутагенной активностью. Пероксид водорода и органические перекиси окисляют основания ДНК до N–окисей, инициируют свободнорадикальные процессы, приводящие к разрушению молекул ДНК [23].

Гидроксильный радикал. Гидроксильный радикал ОН∙ является наиболее реакционным и «вредным» из АКМ, с его образованием часто связывается цитотоксическое и мутаногенное действие АКМ в условиях окислительного стресса. ОН-радикал может разрывать любую С−Н- или С−С-связь, при этом скорость его взаимодействия с большинством органических соединений достигает величин, равных скорости диффузии, в результате чего время жизни ОН∙ в биологических субстратах по разным оценкам составляет от 2х10-9 до 8х10-9 с, а радиус миграции меньше 100 Å, что сравнимо с размерами органических молекул. Другими словами, ОН∙ реагирует с первой попавшейся молекулой, без какой бы то ни было дискриминации.

Основным источником ОН-радикалов в большинстве биологических систем служит реакция Фентона с участием металлов переменной валентности (Fe2+, Cu2+, Co2+, Mn2+, V2+, Cr3+), главным образом Fe2+ и Cu2+:

Н2О2 + Fe2+ → Fe3+ + ОН∙ + ОН−.

Данная реакция названа в честь Фентона, который более 100 лет назад впервые показал высокую окислительную активность сульфата железа в комбинации с перекисью водорода (реактив Фентона).

Цитотоксическое и канцерогенное действие ионизирующих излучений на живые организмы прямо связывается с генерацией ОН∙ в процессе радиолиза воды, на которую приходится основная масса большинства клеток и многоклеточных организмов:

радиация

Н2О ОН∙ + Н+ + ē.

При радиолизе Н2О образуется также О

−

, Н2О2, Н∙, О

, Н2 и

другие соединения, однако исследования показывают, что выход этих продуктов значительно меньше, чем ОН-радикала.

Высокие цитотоксичность и мутагенность гидроксильных радикалов делают актуальным поиск средств защиты от них. Специфических ингибиторов, подобных СОД и каталазе, для ОН-радикала нет и не может быть ввиду высокой неспецифичности его взаимодействия с разными органическими молекулами и разными атомами в молекулах. Низкомолекулярные, легкоокисляющиеся соединения, такие как глутатион, урацил, мочевая кислота, манитол, глюкоза, диметилсульфоксид ингибируют ОН-радикалы и защищают биологические структуры, однако в таком качестве они эффективны только при высоких концентрациях.

Как уже говорилось выше, основным механизмом образования ОН∙ в биологических системах является разложение перекиси водорода, катализируемое ионами металлов переменной валентности (реакции типа Фентоновской), при этом необходимыми условиями генерации ОН∙ является наличие Н2О2 и восстановленных ионов металла. В этой связи для оценки цитотоксического и деструктивного действия ОН∙ важное значение имеет определение наличия в биологических субстратах и клетках металлов переменной валентности, особенно Fe2+ и Cu2+, а также их способности разлагать органические перекиси [21].

Оксид азота. Оксид азота – это парамагнитный газ, молекулы которого имеют неспаренный электрон на внешней π-орбитали. Микробицидное и цитотоксическое действие NO∙ может во многом зависеть от образования окислов азота: нитрита (NO

−

), нитрата (NO

−

)

и пероксинитрита (ОNОO−).

В физиологических условиях NO∙ взаимодействует с молекулярным кислородом с образованием двуокиси азота, в водных растворах разлагающейся на анионы NO

2 NO∙ + О2 → 2NO

−

и NO

−

∙

Н2О

∙

2NO

↔ N2O4 → NO

Н2О

∙

+ N2O4 → NO∙ +2 NO

NO∙ +NO

−

↔ N2O3 → 2 NO

Н2О

−

+ NO

−

+ 2Н+,

−

+ Н+,

−

+ 2Н+.

Высокой токсичностью обладает пероксинитрит, который образуется в реакции NO∙ с супероксид-анионом:

−

+ NO∙ → ОNОO−.

−

и NO

−

− сильные окислители; их цитотоксичность в

отношении E.coli значительно возрастает при низких рН и в присутствии перекиси водорода и миелопероксидазы. Вместе с тем нитрит снижает микробицидное действие гипохлоридов в системе Н2О2−МПО−Сl−.

Пероксинитрит – сильный окислитель, способный окислять NH2- и SH-группы белков. Существенный вклад в цитотоксическое действие пероксинитрита вносит образующийся из него в результате нефентоновской реакции при понижении рН ОН-радикал. Данная реакция не требует участия металлов переменной валентности, содержание которых в клетках в свободном виде мало, кроме того, скорость взаимодействия О

−

с NO∙ выше, чем с СОД, поэтому

некоторые исследователи считают, что это одна из основных клеточных реакций, приводящих к образованию гидроксильного радикала [10]:

ОNОO− + Н+ → ОNОOН → НО∙ + NO

−

Защита клеток и биологически активных соединений от токсического действия АФК и органических свободных радикалов осуществляется антиоксидантами. В общем виде под термином «антиоксиданты» понимают соединения различной химической природы, способные тормозить или устранять свободнорадикальное окисление органических веществ метаболитами молекулярного кислорода [3].

В последнее время получило признание более широкое понятие «биоантиокислители» под которыми понимают полифункциональные соединения. Согласно [62], антиоксидантные системы характеризуются различным принципом действия, а именно:

1. Ингибирование радикальных форм АФК, способных отрывать

атом водорода с образованием органических радикалов;

2. Изменение структурной организации, затрудняющее

окисление;

3. Локальное снижение концентрации О2 и предотвращение его

включения в окисление;

4. Взаимодействие с органическими радикалами и предотвраще-

Вид

антиоксидантов

Локализация

в организме

Механизм действия

1 2 3

Ферменты, белки

Супероксиддисмутаза

Митохондрии и цитоплазма клеткок

Дисмутация анионов супероксида

Каталаза

Клетки, пероксисомы

Глутатионпероксидаза

Клетки

Разрушение Н2О2 и гидроперекисей

Другие пероксидазы

Клеточные мембраны, митохондрии, цитозоль

Разрушение Н2О2

Ферритин

Цитоплазма

Связывание железа

Трансферрин

Плазма крови

Связывание и транспорт железа

Церулоплазмин

Плазма крови

Связывание Си и Fе, инактивация супероксида

ние развития цепных окислительных процессов;

5. Связывание или окисление ионов металлов переменной

валентности, индуцирующих разложение перекисей и образование радикалов;

6. Перевод перекисей в стабильные продукты окисления:

спирты, альдегиды, кетоны.

Одним из наиболее удачных определений такой обширной группы химически разнородных соединений ныне считается следующее: «Антиоксиданты – это любое вещество, которое, присутствуя в низких по сравнению с окисляемым субстратом концентрациях, существенно задерживает или ингибирует его окисление» [62]. Биохимическая система антиоксидантной защиты организма (природные антиоксиданты) приведена в таблице 18.

Таблица 18. Схема биохимической системы антиоксидантной

защиты организма

Окончание табл. 18

1 2 3

Низкомолекулярные антиоксиданты

Витамин Е

Клетки (цитоплазматические мембраны, мембраны митохондрий и лизосом), кровь

Нейтрализация супероксида, радикалов оксида азота и перекисных радикалов

Витамин С

Цитозоль, внеклеточная жидкость

Нейтрализация супероксида, гидроксильного радикала, восстановление окисленного витамина Е

Прочие витамины, напр, витамины В6, Р, РР, К (кроме витамина D)

Цитозоль, внеклеточная жидкость

Нейтрализация кислородных радикалов

Каротиноиды

Мембраны клеток

Защита клеток от синглетного кислорода

Восстановленный глутатион и другие SH-содержащие соединения

Клетки

Защита клеток от радикалов кислорода, предупреждение ПОЛ Убихинон

Митохондрии

Ингибирование ПОЛ

Мочевина, мочевая кислота

Внеклеточная жидкость

Связывание Н2О2, ингибирование ПОЛ

Билирубин

Кровь

Нейтрализация кислородных радикалов

Карнозин

Клетки мозга, сердца и скелетных мышц

Нейтрализация АФК, ингибирование ПОЛ

Селен

Гормоны, белки и ферменты, в частности глутатионпероксидаза

Разрушение Н2О2 и гидроперекисей

Углекислый газ (СО2)

Клетки, плазма крови

Ингибирование образования супероксида

Лабораторная работа 7

ClCl

ONa

ClCl

Определение содержание витамина С в продуктах питания

Определение содержания аскорбиновой кислоты в пищевых продуктах и лекарственных растениях необходимо для составления правильного рациона, удовлетворяющего потребность организма в этом витамине. Богаты витамином С плоды шиповника, черной смородины, цитрусовых. Аскорбиновая кислота участвует в окислительно-восстановительных процессах при синтезе стероидных гормонов, обмене ароматических аминокислот, образовании соединительной ткани.

Метод основан на способности аскорбиновой кислоты восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенол. 2,6-дихлориндофенол в щелочной среде имеет синюю окраску, в кислой – красную, а при восстановлении обесцвечивается:

синий красный бесцветный

Количественное определение витамина С проводят, титруя исследуемый подкисленный соляной кислотой раствор щелочным раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола. Пока в титруемом растворе содержится витамин С, приливаемый щелочной раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола будет обесцвечиваться за счет образования восстановленной формы. Как только все количество витамина С,

<<< < Предыдущая 1 2 3 45 / 95 6 7 8 9 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]