Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Химия биологически активных веществ. Учебное пособие
.pdf
называется пространственно ограниченная совокупность чувствительных биологических элементов и среды, в которой они находятся [5].
Из этой формулировки следует, что понятие «тест-объект»
является составной частью понятия «тест-система» и органично
включается в нее. Тест-объекты это чувствительные элементы,
входящие в тест-систему. Они могут находиться в одном или
различных физиологических состояниях, их пространственное
распределение может быть равномерным, или же они могут
концентрироваться в каких-либо областях (на дне сосуда, на его
стенках, на твердом носителе, у скоплений пищи и т.д.).
Под термином же "тест-организм", который также достаточно
часто используют специалисты, подразумевает систематическое
наименование тест-объекта вплоть до вида, штамма или клона.
Ко всем тест-объектам, предъявляют определенные требования:
- чувствительность к изменениям, протекающим в изучаемой
модели;
- удобство для лабораторного моделирования;
- простота и доступность для широкого использования;
- хорошая воспроизводимость откликов на определенное
изменение исследуемой модели [7].
Также биомодели должны отвечать ряду дополнительных
требований:
- сопоставимость с физиологической реакцией высших
животных;
- быстрота и технологичность по сравнению с традиционными
методами;
- обладание специфическими свойствами, позволяющими
расширить представление о спектре действия тестируемого фактора на
биомассу [8].
Лабораторная работа 13
Определение токсичности пищевых добавок и качества продуктов
питания с помощью биотестирования на инфузориях
Paramecium caudatum
В числе наиболее перспективных организмов, пригодных для
биотестирования, ведущее место занимают представители подцарства
Protozoa.
71
История их применения в качестве тест-организмов насчитывает не одно десятилетие. Методы, в которых используются эти
организмы, обладают высокой чувствительностью, экспрессностью, надежностью, универсальностью и малой себестоимостью.
Они просты в проведении, поддаются инструментализации и
автоматизации, их результаты легко интерпретируемы. По сравнению с биотестами на высших животных, они обладают значительными преимуществами в экономической, методической и этической сферах. Инфузории в качестве тест-объектов в настоящее
время применяют в четырех основных областях: при первичной
оценке токсичности новых химических веществ; при определении
состояния высших организмов по токсичности их внутренних сред
(кровь, лимфа и др.); при проверке на токсичность природных и
сточных вод; при оценке общей токсичности кормов и пищевых
продуктов [5].
Инфузории представляют собой одноклеточные эукариотические организмы, то есть у них есть ядро (а у многих видов
инфузорий даже два ядра). Это особенно важно, если учесть,
что почти все клетки человека и других высших животных
имеют ядра. Инфузории были одним из любимых объектов биологов еще лет сто назад, но и сейчас они остаются в центре внимания [6].
Характерная особенность инфузорий – относительно быстрая
изменчивость, которая позволяет им адаптироваться к самым разным
условиям.
Инфузория туфелька (рис. 17) относится к подцарству простейших или одноклеточных животных (Protozoa) к многочисленному (свыше 7 тысяч видов) типу реснитчатых или инфузорий
(Ciliophora), к роду Paramecium, виду Paramecium caudatum [9]. Свое
название данный вид получил за внешнее сходство с подошвой
туфельки [10].
Инфузория туфелька – это довольно крупный организм
эллипсоидной формы с размерами тела 0,2 × 0,04 мм. Она широко
распространена в природе [9, 11].
По сравнению с другими группами простейших инфузории
имеют наиболее сложное строение и отличаются разнообразием и
сложностью функций [9].
72
Рис. 17. Paramecium caudatum: А – отдельная клетка
(увеличение 7 × 100); Б – скопление Paramecium caudatum
около дрожжей (увеличение 7 × 20)
Инфузории как тест организмы обладают определенными
преимуществами:
1) как эукариотические организмы, они обладают свойствами
отдельного организма и клетки, в силу чего могут быть использованы
при биотестировании как интегральные датчики на совокупность
действующих факторов и одноклеточные тест - организмы при оценке
цитотоксичности;
2) с их помощью возможна оценка токсичности соединений,
растворимых в воде и в ряде органических растворителей;
3) накоплен большой статический материал, свидетельст-
вующий о высокой чувствительности инфузорий к тяжелым металлам,
пестицидам, микотоксинам и другим загрязняющим веществам;
4) в связи с большими размерами клеток состояние инфузорий
легко оценивать визуально под микроскопом;
5) стоимость лабораторного содержания инфузорий гораздо
ниже стоимости содержания экспериментальных животных [16].
В биотестах на инфузориях проще всего фиксировать изменение
подвижности, гибель и скорость размножения. Например, можно
смотреть изменение подвижности за 15–30 мин; гибель отдельных
клеток за 1-4 часа; снижение скорости размножения за 1–3 суток;
гибель популяции за 4-30 суток.
В экологических целях биотесты применяют и как отдельные
методы, и в комплексных исследованиях. Биотесты также используют
73
для оценки токсичности кормов, лекарств, полимерных материалов и
питьевой воды. А вот безопасность пищевых продуктов и пищевых
добавок с помощью биотестирования не определяют. Но если б
определяли, была бы от этого польза? Прежде чем ответить на этот
вопрос, рассмотрим состав современных продуктов.
Допустим, мелким шрифтом на упаковке написано, что пищевой
продукт содержит загадочные Е102, Е214, Е342, Е621. Технолог знает,
что Е с номерами от 100 до 182 – красители, от 200 до 299 –
консерванты, от 300 до 399 – антиоксиданты и регуляторы
кислотности, от 600 до 699 – ароматизаторы и усилители вкуса.
В частности, Е102 – краситель тартразин, Е214 – этиловый эфир
парагидроксибензойной кислоты, Е342 – фосфаты аммония,
Е621 – глутамат натрия. Все эти добавки разрешены в РФ, но, если
говорить о мире в целом, на каждое из этих веществ имеется
«компромат»: тартразин запрещен в ряде стран, глутамат не
рекомендован к применению в детском питании.
Поскольку один продукт обычно содержит множество добавок,
он может оказаться более вредным для здоровья, чем каждый
компонент в отдельности.
Возможно, именно поэтому список нежелательных соединений
постоянно растет; в него попадают и те, которые первоначально
разрешили. Медики уже обнаружили канцерогенное, гепатотоксическое, неиротоксическое и аллергическое действие некоторых пищевых
красителей, консервантов, антиокислителей, усилителей вкуса и
подсластителей. Один из любимых аргументов у сторонников
искусственных химических компонентов – их незначительные
концентрации в пище при значительной эффективности. Однако,
несмотря на малые количества каждой добавки, совокупное их
действие в одном продукте может быть опасным для человека.
Патологические изменения метаболизма начинаются уже с
пищеварения. Некоторые из этих веществ блокируют пищеварительные ферменты, из-за чего организм человека не может эффективно
использовать питательные компоненты пищи. В результате начинает
бурно размножаться гнилостная микрофлора толстого кишечника.
Это происходит еще и потому, что пищевые добавки из группы консервантов угнетают полезные бифидум- и лактобактерии. А метаболиты гнилостных микроорганизмов (триптамин, спермидин, индол и скатол), попадая в кровь, отравляют
организм.
74
Сами низкомолекулярные пищевые добавки тоже хорошо
всасываются в желудочно-кишечном тракте и с кровью попадают в
клетки тканей и органов. Их биохимические эффекты так же
разнообразны, как и химическое строение. Так, например, пищевые
азокрасители провоцируют свободно-радикальное окисление липидов,
которое, в свою очередь, нарушает структуру и проницаемость
мембран клеток. Свободные радикалы, участвуя в лавинообразном
процессе пероксидного окисления, могут быть причиной опухолей и
преждевременного старения.
Целью данной работы является биотестирование различных пищевых добавок и пищевых продуктов с помощью инфузорий.
Подготовка культуры Paramecium caudatum к биотестированию. В работе использовали 3 суточную культуру инфузорий
Paramecium caudatum. Инфузории культивировали в пробирках при
комнатной температуре на среде Лозин-Лозинского, которая имеет
следующий состав (г/л):
1. NaCL – 0,1;
2. KCL – 0,01;
3. CaCL2 – 0,01;
4. MgCL2 – 0,01;
5. NaHCO3 – 0,02;
6. вода дистиллированная – 1000 мл [25].
Среду предварительно автоклавировали в течение 30 мин. при
давлении 1,5 атм. Субстратом для инфузорий во время
культивирования служила суспензия хлебопекарных дрожжей
Sacсharomyces cerevisiae, приготовленная на среде Лозин-Лозинского:
брали 15-20 гранул сухих дрожжей на 10 см3 среды. Подкормку
инфузорий осуществляли ежедневно по 1-2 капли дрожжевой
суспензии на пробирку (10-12 мл) Показателем хорошего состояния
культуры являлось образование парамециями «кольца» ниже мениска
пробирки.
Проведение эксперимента
В лунку микрооаквариума помещали 5-8 особей 3 суточной
культуры инфузорий и добавляли раствор пищевой добавки
(в концентрациях 1-7%) в количестве 300 мкл. Эксперимент
проводили в 3-кратной повторности. Через 20 мин, 1 час и 2 часа
75
подсчитывали количество выживших инфузорий. Параллельно
%,100
к
ок
К
ККТ
подобный эксперимент проводили на дихлорированной водопроводной воде (контрольная проба).
Токсичность добавки выражали в %:
где Кк – количество выживших инфузорий в контрольной пробе;
Ко – количество выживших инфузорий в опытной пробе.
При Т ≤ 10 % тестируемая проба не оказывает острого
токсического действия.
При Т ≥ 50 % тестируемая проба оказывает острое токсичное
действие.
Аналогичный эксперимент проводили с напитками (как вариант
лимонад, кока-кола, кофе, чай).
На основании полученных результатов ранжировали изученные
пищевые добавки и напитки по токсичности.
Лабораторная работа 14
Влияние антиоксидантов на ростовые параметры E.coli
и ее стрессоустойчивость
E.coli является одной из наиболее изученных прокариотических
клеток. По размерам Е.coli – весьма подходящий объект для
исследований, к тому же она поразительно быстро размножается:
делится каждые 20 минут. При достаточном количестве воды,
глюкозы (или лактозы) за десять часов из одной Е.coli можно получить
свыше 1 млрд клеток [4].
Escherichia coli (рис. 18) представляют собой короткие
полиморфные палочки длиной 1,5–4 мкм и шириной 0,5–0,8 мкм [9].
Имеют перитрихиально распложенные жгутики. Встречаются
неподвижные штаммы. Некоторые разновидности образуют капсулу.
Факультативные анаэробы, хорошо растут на простых питательных
средах при рН 7,2–7,8 и температуре 37°С, но выдерживают довольно
значительные колебания этих показателей. При росте в жидких средах
Е.coli дают диффузное помутнение и осадок [5].
76
Рис. 18. Escherichia coli
В качестве тест-объекта в данной лабораторной работе
используется E.coli M-180. Грамотрицательная бактерия, факультативный анаэроб, не образует эндоспор.
При проведении исследования использовались суточную культуру E.coli M-180, выращенную на твердой питательной среде МПА
(мясопептонный агар) при температуре 37ºС.
Культивирование E.coli M-180 при биотестировании (контрольные пробы) и приготовление инокулята осуществляли на минеральной среде М 9, которая имеет следующий состав (г/л) [21]:
Na2HPO4 12 H2O - 1,5 г.;
KH2 PO4 - 3 г.;
Na2SO4 - 0,6 г.;
NH4Cl - 1 г.;
MgCl2 6 H2O - 0,5 г.;
CaCl2 - 0,01 г.;
Глюкоза - 0,5 г.
Вода дистиллированная – 1000 мл.
В опытные пробы в среду М-9 дополнительно вводили
антиоксиданты (цистин, аскорбиновая кислота).
Для культивирования использовали конические плоскодонные
колбы на 250 мл, в которые вносили по 40 мл приготовленной
питательной среды. Колбы со средой автоклавировали (при 1 атм.,
20 мин). Затем в остывшие колбы стерильно делали смыв
77
бактериальных культур с твердой питательной среды (МПА) для
,
t
DD
V
nk
приготовления инокулята. Инокулят выращивали в течение суток на
качалках со скоростью вращения 150 об/мин при температуре 35 °С.
В колбы с соответствующей синтетической питательной средой
(40 мл) стерильно вносили суточный инокулят бактериальных культур
из расчета того, чтобы значение начальной оптической плотности
примерно было равно 0,1. E.coli M-180 культивировали в аэробных
условиях на качалках со скоростью вращения 150 об/мин при
температуре 35°С. За ростом бактерий следили по изменению
оптической плотности (каждые 20 минут).
Измерение оптической плотности. Оптическую плотность
измеряли на концентрационном фотоэлектрическом колориметре
КФК-2 при длине волны 590 нм через каждые 30 мин.
культивирования в 1 см кварцевых кюветах.
Скорость роста бактериальных культур определяли для
логарифмической фазы на кривой роста, построенной как функция
оптической плотности от времени их культивирования. Для этого, по
графику определяли оптическую плотность на первом и последнем
часе экспоненциальной фазе роста и ее длительность.
Скорость роста рассчитывали по следующей формуле:
где Dk – оптическая плотность, соответствующая последнему часу
экспоненциальной фазы роста, в процентах от начального значения D;
Dn – оптическая плотность, соответствующая первому часу
экспоненциальной фазе роста, в процентах от начального значения D;
t – длительность экспоненциальной фазы роста, ч.
78
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Биохимия: учебник / под ред. Е.С. Северина. – 2-е изд.,
исправ. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. – 784 с.
2. Биохимия: метод. указания к лабораторному практикуму /
сост. Л.В. Лопухов, Ю.В. Балакирева; Федер. агентство по
образованию, Казан. гос. технол. ун-т. – Казань: КГТУ, 2010. –
68 с.
3. Справочник биохимика: Пер. с англ./ Р. Досон [и др.]. – М.:
Мир, 1991. – 544 с.
4. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых
кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование / Л. А. Остерман. ‒
М.: Наука, 1981. – 288 с.
5. Электрофорез. Клинико-диагностическая интерпретация
электрофореграмм белков сыворотки крови: учебно-методическое
пособие / Карягина И. Ю. – СПб.: СПбГУ, 2000. – 100 с.
6. Руководство по анализу электрофоретических гелей с
помощью программы Scion Image: учебно-методическое пособие /
Казан. гос. технол. ун-т; сост. М. Р. Шарипова, Л. В. Лопухов. –
Казань, 2004. – 12 с.
7. Горбатова К. К. Биохимия молока и молочных продуктов /
К. К. Горбатова. ‒ М.: Колос, 1997. ‒ 206 с.
8. Anderson NG, Power MT, Tollaksen SL. Proteins of human milk.
I. Identification of major components. Clin Chem. – 1982. – 28 –
p. 1045–1055.
9. Методы определения редокс-статуса культивируемых
клеток растений: учебно-методическое пособие/ Г.В. Сибгатуллина
[и др.]. – Казань: Изд-во Казанского федерального университета,
2011. – 61 с.
10. Жеребцов Н.А. Биохимия: учебник / Н.А. Жеребцов,
Т.Н. Попова, В.Г. Артюхов. – Воронеж: Издательство Воронежского
государственного университета, 2002. – 696 с.
11. Абрамов Ж.И., Человек и противоокислительные вещества / Ж.И. Абрамов, Г.И. Оксенгендлер. – Л.: Наука, 1985. –
230 с.
12. Гальваностатическая кулонометрия для оценки антиоксидантной активности молока и молочных продуктов: научнометодическое пособие/ Ю.В. Балакирева [и др.]. – М.: РАЕН, 2009. –
60 с.
79
13. Зенков Н.К., Окислительный стресс: биохимический и
патофизический аспенкты / Н.К. Зенков, В.З. Ланкин,
Е.Б. Меньшикова. – М.: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2001. –
343 с.
14. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище. – М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. –
240 с.
15. Шапиро Д.К. Практикум по биологической химии /
Д.К. Шапиро. – 2-е изд. – Минск: Вышэйшая школа. – 1976. –
288 с.
16. Починова Т.В. Химия пищи: лабораторный практикум студентов специальности 260303.65. Технология молока и
молочных продуктов/ Т.В. Починова. – Димитровград: Технологический институт – филиал ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА»,
2010. – 40 с.
17. Барабой В.А. Перекисное окисление и стресс / В.А. Барабой,
И.И. Брехман, В.Г. Голотин. – СПб.: Наука, 1992. – 148 с.
18. Яковец О.Г. Фитофизиология стресса / О.Г. Яковец. – Минск:
БГУ, 2009. – 101 с.
19. Селье Г. Стресс без дистресса / Г. Селье. − М.: Прогресс,
1982. – 125 с.
20. Колупаев Ю.Е. Пролин: физиологические функции и
регуляция содержания в растениях в стрессовых условиях /
Ю.Е. Колупаев, А.А. Вайнер, Т.О. Ястреб // Вестник Харьковского
национального университета. Серия «Биология». 2014. Вып. 2 (32). –
С. 6–22.
21. Султангазина Г.Ж. Физиология растений: учебно-
методическое пособие (курс лекций). Костанай: КГУ им. А. Байтурсынова, 2012. – 72 с.
22. В.В. Рогожин, Т.В. Рогожина. Практикум по физиологии и биохимии растений: учебное пособие. – СПб.: ГИОРД, 2013. –
352 с.
23. Евгеньев М.И. Тест-методы и экология, биология/
М.И. Евгеньев // Соросовский образовательный журнал, 1999. –
10 с.
24. Ляшенко О.А. Биоиндикация и биотестирование в охране
окружающей среды: учебное пособие / О.А. Ляшенко. – СПБ.:
СПбГТУРП, 2012. – 67 с.
80
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]