Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Химия биологически активных веществ. Учебное пособие
.pdf
изменению функции белка и его деградации. Вторичные эффекты
АФК на белок включают фрагментацию, нарушение нативной
структуры и образование поперечных сшивок.
− Молекулы ДНК. Окислительная модификация клетки
отражается на состоянии клеточной ДНК. Как ядерная, так и
митохондриальная ДНК являются мишенью для АФК. Наиболее часто
встречаются гидроксилирование нуклеиновых оснований и разрыв
цепей ДНК, приводящие к утрате АТФ и генным мутациям, которые, в
свою очередь, приводят к злокачественному перерождению тканей
и/или клеточной смерти. Супероксид-анион-радикал относительно
неактивен в отношении молекул ДНК, но такие АФК, как NO и
пероксинитрит, могут непосредственно повреждать хроматиновый
материал.
Наиболее значительные модификации ДНК вызываются
гидроксид-радикалом [24].
Существованию множества стрессоров соответствует наличию
многих мишеней. Главным условием для выживания организма
является целостность клеточной мембраны, поддержание правильной
укладки белков и интегративность ДНК [6].
Лабораторная работа 10
Влияние тяжелых металлов на накопление пролина
в проростках растений
Биологические функции органических протекторных соединений крайне многообразны. Например, пролин, который является в
растительном мире самым универсальным осмолитом, может
выступать в роли источника азота, углерода и энергетического
субстрата. Он обладает также антиоксидантным действием, понижая
количество активных форм кислорода.
61
Аккумуляция пролина возникает в растительных клетках при
действии практически любых стрессовых факторов: холод, засуха,
тяжелые металлы, ультрафиолет. Стресс-индуцированное накопление
пролина в растительных клетках обладает мультифункциональным
действием на клеточный метаболизм, помогая растениям
адаптироваться к неблагоприятным условиям, защищая от
инактивации белки, ДНК, ряд ферментов и другие важнейшие
клеточные компоненты.
Одним из химических свойств пролина, входящих в
современную концепцию о противодействии накоплению в клетках
АФК, значительно опережающих повреждающее действие многих
абиотических факторов, является его способность “тушить“
синглетный кислород (1O2) и гидроксил радикал (OH°). Среди
совместимых метаболитов, аккумулирующихся в растениях при
стрессах, только для пролина показан эффект «тушения» синглетного
кислорода, образующегося в первые часы действия стрессора.
Реактивы и оборудование
18% раствор сахарозы; 3% раствор сульфосалициловой кислоты;
нингидрин; ледяная уксусная кислота; фосфорная кислота (6 моль/л);
толуол; пролин; торзионные весы; сушильный шкаф; ступки; водяная
баня; кюветы со льдом; пробирки; стеклянные воронки; пипетки;
складчатые фильтры; колбы на 50 мл; чашки Петри; ФЭК.
Ход работы
1. В чашках Петри на фильтровальной бумаге в воде
выращивают 7-10-дневные проростки овса, пшеницы, гороха или
фасоли. Затем воду сливают и заливают в чашки 18% раствор
сахарозы. Через 48 или 72 ч определяют содержание пролина в
срезанных листьях после осматического стресса, предварительно
определив его исходное содержание. Параллельно берут две-три
пробы листьев (100 мг), высушивают их при 105 оС и находят сухую
массу.
2. Для определения свободного пролина берут три пробы
листьев по 1 г каждая. Мелко их нарезают, заливают 10 мл 3%
раствора сульфосалициловой кислоты и растирают в течение 5 мин в
62
ступках до получения однородной массы, растертую массу переносят
на фильтр.
3. Берут 2 мл фильтрата, помещают в пробирки и добавляют
2 мл реагента, который готовят непосредственно перед опытом,
растворяя 1,25 г нингидрина в смеси 30 мл ледяной уксусной кислоты
и 20 мл фосфорной кислоты (6 моль/л). Затем в пробирки добавляют
2 мл ледяной уксусной кислоты. После тщательного перемешивания
содержимого пробирки ставят на 1 ч в кипящую водяную баню.
4. После этого пробирки охлаждают под холодной водой или в
ледяной бане. Далее в каждую пробирку добавляют 4 мл толуола,
взбалтывают 20-30 с и дают отстояться. Через 10-15 мин верхний слой
толуола, в который переходит весь краситель, отделяют от водной
фазы. Окрашивание может быть от слаборозового до пурпурного в
зависимости от содержания пролина.
5. Интенсивность окраски измеряют на ФЭКе при длине
волны 520 нм против толуола. Концентрацию пролина определяют по
калибровочной кривой, для построения которой готовят водные
растворы пролина разных концентраций (от 0,0125 до 0,15 мг в 2 мл
раствора). Результаты расчета выражают с мг% на сухое вещество,
предварительно определив, сколько сухого вещества содержится в 1 г
сырых листьев в контроле и при недостатке воды.
Лабораторная работа 11
Влияние тяжелых металлов на ростовые характеристики
проростков пшеницы и кукурузы и их каталазную активность
Каталаза (от греч. καταλύω – разрушать, ломать) – важнейший
фермент антиоксидантной защитной системы. Она обнаружена
практически во всех живых организмах – как животных, так и
растительных. Каталаза имеет жизненно важное значение, поскольку
участвует в биохимическом механизме поддержания нормального
уровня обмена перекиси водорода, которая из-за своей токсичности не
должна накапливаться:
2H2O2 → 2H2O + O2
Благодаря этому она и проявляет антиоксидантные свойства.
Семена кукурузы и пшеницы необходимо вымочить в течение
20 мин в растворе перманганата калия, после этого промыть
63
дистиллированной водой и проращивать на влажной фильтровальной
Сильные проростки
баллы
Длина проростка 5 см, лист вышел из колеоптиле или равен
его длине, число зародышевых корешков – 5
5
Длинв проростка не менее 4 см, лист в колеоптиле превышает
¾ его длины, число зародышевых корешков – не менее 4
4
Длина проростка менее 2,5 см, лист в колеоптиле более ½ его
длины, число зародышевых корешков – не менее 3
3
Слабые проростки
Длина ростка менее 2 см, число зародышевых корешков – 2
2
Росток по своим размерам менее двух длин зерновки, число
зародышевых корешков – 2 и менее
1
бумаге в чашках Петри на свету в течение 7 суток. Контрольные
семена проращивают в дистиллированной воде, опытные в растворе
солей тяжелых металлов (CuSO4 0,1 мг/мл).
У семидневных проростков определяют такие ростовые
характеристики как длину и толщину главного корня, количество
придаточных корней и длину стебля (рис. 15). Оценку проросткам
осуществляют по пятибалльной шкале, согласно таблице 19.
Рис. 15. Строение проростков (а) пшеницы, (б) кукурузы
Таблица 19. Оценка проростков по пятибалльной шкале
64
Каталазную активность определяют для корней проростков и их
pktVAAE
dk
)(
зеленой части. Для этого отрезают корни и степли проростком,
промокают их фильтровальной бумагой и взвешивают 200-300 мг.
которые растирают в холодной фарфоровой ступке холодным
пестиком с 0,5 мл ацетатного буфера (рН 5,0).
Полученный гомогенат центрифугируют в течение 5 мин при
12000 g.
При определении активности каталазы исследуемых растений
использовали метод, основанный на способности перекиси водорода
образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс
(Королюк и др., 1988). Для этого реакцию запускали добавлением
0,1 мл растительного гомогената к 2 мл 0,03% раствора перекиси
водорода. В качестве контрольной пробы использовали 0,1 мл
дистиллированной воды. Реакцию останавливали через 10 мин
добавлением 4% молибдата аммония. Затем измеряли интенсивность
окраски на фотоколориметре КФК-2 при длине волны 410 нм против
контрольной пробы, в которой вместо перекиси водорода вносили
2 мл воды. Расчет измерений проводили следующим образом:
(мкат/л),
где E – активность каталазы в мкат/л;
A – оптическая плотность контрольной и опытной проб;
V – объем вносимой пробы, 0,1 мл;
t – время инкубации, 600 сек;
k – коэффициент миллимолярной экстинции перекиси водорода,
равный 22,2х103 мМ
-1
см -1.
За единицу активности каталазы принимали то количество
фермента, которое участвует в превращении 1 мкат перекиси водорода
за 1 сек при заданных условиях.
Лабораторная работа 12
Влияние тяжелых металлов на ростовые характеристики
и активность пероксидаз проростков гороха
На протяжении всей жизни растения подвергаются действию
различных стрессовых факторов (действие фитопатогенов, фитофагов,
тяжелых металлов, неблагоприятных климатических В связи с этим,
65
одной из важнейших проблем является изучение механизмов их
устойчивости к действию неблагоприятных факторов окружающей
среды.
Особый интерес исследователей вызывают пероксидазы –
ферменты класса оксидоредуктаз, катализирующие с помощью H2O2
окисление различных неорганических и органических веществ.
В живой клетке пероксидазы играют ключевую роль в поддержании
молекул в восстановленном состоянии, что является одним из
основных условий для нормального существования живых
организмов. Пероксидазы принадлежат к числу индуцибельных
ферментов, под влиянием самых разнообразных воздействий либо
меняется набор их изоформ, либо повышается активность уже
присутствующих молекулярных форм [1].
В литературе имеются данные об изменении активности пероксидаз у растений, пораженных патогенными микроорганизмами. Взаимодействуя с клеткой растения-хозяина, патоген
индуцирует в ней целую цепь реакций. Повышение окислительного
обмена и активности пероксидазы – результат действия лишь одного
из звеньев сложной цепи процессов, изучение которых представляет
интерес для выявления устойчивости растений к негативному
воздействию.
Семена гороха необходимо вымочить в течение 20 мин в
растворе перманганата калия, после этого промыть дистиллированной
водой и проращивать на влажной фильтровальной бумаге в темноте в
течение 3 суток. Затем проростки поместить на 5-7 суток на 1/4 нормы
питательной среды Хогланда–Арнона при 25°C и освещении
люминесцентными лампами при 10-часовом световом периоде.
В опытные пробы в среду роста добавить соли тяжелых металлов
(CuSO4 0,1 мг/мл). Контрольные растения выращивать на среде
Хогланда-Арнона.
Эксперимент проводят с 5 или 7 дневными растениями.
У опытных и контрольных растений определяли такие ростовые
характеристики как длина и толщина первичного корня, боковых
корней, длину стебля, размеры листовой пластины (рис. 16).
Для исследования пероксидазной активности берут корни гороха
массой 200-300 мг, которые растирают в холодной фарфоровой ступке
холодным пестиком с 0,5 мл ацетатного буфера (рН 5,0).
Полученный гомогенат центрифугируют в течение 5 мин при
12000 g. Пробы помещают в холодильник при +4 °С.
66
Рис. 16. Строение проростка гороха
Для определения пероксидазной активности использовали
колориметрический метод по Бояркину (Ермаков, 1987). Метод
основан на определении скорости реакции окисления бензидина до
образования синего продукта его окисления в присутствии перекиси
водорода и пероксидазы:
Измерение оптической плотности производят при длине волны
590 нм в течение 120 с.
67
Необходимые реактивы
1) 0,2М Na-ацетатный буфер, готовят из следующих концентрированных растворов (сток-растворов): 0,2 М CH3COOH
(2,4 мл CH3COOH довести до 200 мл дистиллированной водой)
и 0,2 М CH3COONa (5,44 г CH3COONa довести до 200 мл
дистиллированной водой). Для приготовления 100 мл раствора
(рН 5,0) 30 мл 0,2 М раствора CH3COOH и 70 мл 0,2 М раствора CH3COONa. Смешать и проверить рН буфера, при несоответствии откорректировать с помощью концентрированной HCl
и 5% NaOH.
Перед использованием в ацетатный буфер добавить 100 мМ
ФМСФ (34 мг фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) растворить в
2 мл изопропилового спирта) из расчета 20 мкл ФМСФ на 2 мл
буфера.
2) 0,01% раствор соляно-кислого бензидина (на 10 проб: 5,6 мг
бензидина-HCl растворить в 1 мл концентрированной уксусной
кислоты и довести до 6 мл дистиллированной водой).
3) 0,3% перекись водорода (0,5 мл аптечной перекиси довести до
5 мл дистиллированной водой).
Ход работы
Навеску каллусной ткани массой 200-300 мг растереть в
холодной фарфоровой ступке холодным пестиком с 0,5 мл ацетатного
буфера (рН 5,0), содержащим 100 мМ ФМСФ.
Полученный гомогенат центрифугировать в течение 5 мин при
12 000 g. Пробы поместить в холодильник при +4 °С.
Реакционная смесь содержит:
0,98 мл 0,2М Na-ацетатного буфера (рН 5,0);
0,5 мл 0,01% раствора соляно-кислого бензидина;
0,02 мл экстракта;
0,5 мл 0,3% перекиси водорода.
Контрольная кювета содержит:
1,48 мл 0,2 М Na-ацетатного буфера (рН 5,0);
0,5 мл 0,01% раствора соляно-кислого бензидина;
0,02 мл экстракта.
68
Расчет активности пероксидазы проводится по формуле:
,
mmLT
XVD
А
,
))((
CL
XTD
A
где А – активность;
ΔD – изменение оптической плотности (вычесть из оптической
плотности в конце реакции оптическую плотность в начальный
момент времени);
V – общий объем полученной вытяжки, мл;
X – конечное разведение вытяжки в кювете (объем реакционной
смеси разделить на количество вносимого экстракта);
T – время реакции, с;
L – толщина слоя, см;
m – масса навески, г;
Δm – отношение сухого веса к сырому (см. методику
определения соотношения сырого и сухого веса).
Активность выражают в относительных единицах на один грамм
сухого веса.
Для определения активности фермента на мг белка использовали
следующую формулу:
где А – активность фермента;
ΔD – изменение оптической плотности (вычесть из оптической
плотности в конце реакции оптическую плотность в начальный
момент времени);
X – конечное разведение вытяжки в кювете (объем реакционной
смеси разделить на количество вносимого экстракта);
T – время реакции, с;
L – толщина слоя, см;
С – содержание белка в пробе, мг (см. методику по определению
содержания белка в пробе).
Измерение активности пероксидазы проводят в нескольких
повторностях (не менее трех). Стандартную ошибку вычисляют в
программе Microsoft Office Word (опция «Описательная статистика»).
69
3. БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДЛЯ ОЦЕНКИ
КАЧЕСТВА СРЕДЫ
В широком смысле под биотестированием понимают приемы
исследования, при котором о качестве среды, факторах, действующих
самостоятельно или в сочетании с другими, судят по выживаемости,
состоянию и поведению специально помещенных в эту среду
организмов – тест-объектов [3].
Также под биотестированием понимают оценку (испытание) в
строго определенных условиях действия вещества или комплекса
веществ на живые организмы путем регистрации изменений того или
иного биологического или физиолого-биохимического показателя
исследуемого объекта по сравнению с контролем [4].
В наиболее завершенной формулировке под биотестированием
понимается оценку свойств изучаемого объекта по его воздействию на
биологическую тест-систему в стандартных условиях.
Данная формулировка включает в сферу рассмотрения любые
методы, в которых для изучения какого-либо явления используются
биологические объекты. Это позволяет анализировать и сопоставлять
биологические тесты, применяемые в разных областях, с единой точки
зрения.
Введение в данное определение понятия «тест-система» не
является случайным. Как правило, для обозначения живого элемента,
на котором производится постановка биологического теста
используют иные понятия, такие как «тест-организм» и «тест-объект».
Между тем в общем случае мы имеем дело не просто с отдельными
организмами, а с биологической системой, имеющей внутреннюю
структуру, определяемую связями между ее биологическими
элементами и средой, в которой они находятся. Эта система может
состоять из группы организмов одного вида, сообщества нескольких
видов, целой экосистемы, или же может включать отдельные органы и
ткани организма, культуру клеток, изолированные органеллы,
ферменты и т.д. Эти биологические элементы распределены в среде и
заключены в определенном объеме. Именно тест-система, а не просто
отдельные живые организмы, является центральным элементом
процесса биотестирования, и уяснение сути этого термина дает ключ к
научному пониманию процесса биотестирования, как такового, а,
следовательно, и к целенаправленному управлению им. Тест-системой
70
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]