Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Химия биологически активных веществ. Учебное пособие
.pdf
имеющееся в исследуемом растворе, окислится, титруемый раствор
ClCl
O
N
OH
OH
ClCl
NH
OH
C
C
O
HO
C
C
HO
H
CHO
CH2OH
H
O
C
C
O
O
C
C
O
H
CHO
CH2OH
H
O
HCl
аскорбиновая
кислота
2,6-дихлорфенол-
индофенол
дегидроас-
корбиновая
кислота
лейкоформа
2,6-дихлорфенол-
индофенола
приобретает розовую окраску за счет образования недиссоциированных молекул 2,6-дихлорфенолиндофенола в кислой
среде:
фенолиндофенола; 2% раствор соляной кислоты.
вата; мерная колба на 100 мл; коническая колбочка на 25 мл; пипетки
на 5 и 10 мл; микробюретка.
хвои 0,5 г. Исследуемый материал помещают в ступку и растирают,
постепенно добавляя 5 мл раствора соляной кислоты. Вытяжку
фильтруют через тонкий слой ваты в мерную колбу на 100 мл.
Извлечение витамина С из той же навески повторяют еще два раза,
каждый раз добавляя по 5 мл раствора соляной кислоты и фильтруя
полученную вытяжку в ту же мерную колбу. Далее содержимое колбы
доводят до метки дистиллированной водой.
Исследуемый материал: картофель, капуста, хвоя.
Реактивы: 0,001 М раствор натриевой соли 2,6-дихлор-
Оборудование: весы с разновесом; ступка с пестиком; воронка;
Ход работы
На весах берут навеску картофеля 2 г., или капусты 2 г., или
51
Для определения отбирают 10 мл вытяжки в коническую
,
10
1000100088,0
a
V
Х
O
O
O
OH
HO
O
O
OH
OH
(C12H21O9)
2
колбочку и титруют содержимое раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола, налитого в микробюретку, до появления розового
окрашивания, не исчезающего в течение 30 с.
Расчет проводят по формуле
где Х – содержание аскорбиновой кислоты, мг/кг;
0,088 – титр аскорбиновой кислоты по 0,001 М раствору
2,6-дихлорфенолиндофенола, мг/мл;
100 – разведение (объем мерной колбы), мл;
1000 – коэффициент пересчета на 1 кг сырья, г;
10 – объем жидкости взятый для титрования, мл;
V – объем 2,6-дихлорфенолиндофенола, пошедший на
титрование, мл;
а – навеска исследуемого материала, г.
Лабораторная работа 8
Количественное определение рутина в чае
В основе витамина Р лежит ядро флавона. Известно несколько
соединений, обладающих Р-витаминным действием. Рутин (рутозид) –
это гликозид флавона кверцитина и дисахарида рутинозы (глюкоза и
рамноза):
флавон рутин
Рутин – кристаллическое вещество желто-оранжевой окраски.
Содержится в тех же продуктах, что и витамин С. В чае содержится
30-50 мг% рутина, в зеленом чае – несколько больше.
52
Метод основан на способности рутина окисляться перман-
,
1,010
1000500032,0
V
X
ганатом калия. В качестве индикатора используется индигокармин,
который вступает в реакцию с калия перманганатом после того, как
окислится весь рутин.
Материал исследования: черный или зеленый чай.
Реактивы: 0,05 н. раствор перманганата калия; индикатор
индигокармин.
Ход работы
В коническую колбу к 0,1 г чая приливают 40 мл горячей воды и
проводят экстракцию при нагревании на водяной бане в течение
5 минут. Далее раствор фильтруют в мерную колбу на 50 мл и доводят
водой до метки дистиллированной водой. Для титрования пипеткой
отмеривают в колбу для титрования 10 мл экстракта, добавляют 10 мл
дистиллированной воды и 5 капель индигокармина, при этом
появляется синее окрашивание. Титруют из микробюретки раствором
KMnO4 до появления устойчивой желтой окраски.
Расчет проводят по формуле
где Х – содержание рутина, мг/кг;
0,0032 – титр рутина по 0,05 н. раствору KMnO4, мг/мл;
50 – разведение (объем мерной колбы), мл;
1000 – коэффициент пересчета на 1 кг сырья, г;
10 – объем жидкости взятый для титрования, мл;
V – объем KMnO4, пошедший на титрование, мл;
а – навеска исследуемого материала, г.
Лабораторная работа 9
Определение изменения перекисного числа и содержания
изомеров кислот с сопряженными связями в пищевых
продуктах в процессе технологической обработки
Цель работы: определить содержание сопряженных двойных
связей в растительных жирах в процессе технологической обработки в
продуктах, содержащих и не содержащих антиоксиданты. Определить
53
изменение перекисного числа жиров. Определить изменение
состояния жиров при автоокислении и термоокислении.
Липиды широко распространены в природе и вместе с белками и
углеводами составляют основную массу органических веществ всех
живых организмов. Они широко используются при получении многих
продуктов питания, являются важными компонентами пищевого
сырья и готовых продуктов, во многом определяя их пищевую
ценность и вкусовые качества.
Липиды нерастворимы в воде, но хорошо растворимы в
органических растворителях (бензине, хлороформе, диэтиловом эфире
и др.)
По химическому строению липиды являются производными
жирных кислот, спиртов, альдегидов. Наиболее важная и распространенная группа липидов – ацилглицерины или жиры.
В маслах и жирах, выделенных из различных объектов,
содержатся насыщенные и ненасыщенные углеводороды С10-С40
различного строения. В питании большое значение имеет химический
состав употребляемых жиров, особенно содержание полиненасыщенных кислот с определенным положением двойных связей и
цис-конфигурацией (линолевой С2 18, линоленовой С3 18, олеиновой С1 18, арахидоновой С4 20, полиненасыщенных жирных кислот
семейства омега-3).
Наиболее важные источники жиров в питании - растительные масла (в рафинированных маслах 99,7-99,8% жира), сливочное масло (61,5-82,5% липидов), маргарин (до 82,0% жира), молочные продукты (3,5-30% жира), сыры (25-50% жира), шоколад
(35-40%)
Жиры нестойки при хранении. Они являются наиболее
лабильными компонентами пищевого сырья и готовых пищевых
продуктов. Главными направлениями превращения липидов при
хранении являются гидролиз, окислительное и биохимическое
прогоркание.
Приборы и реактивы: терки; ножи; разделочные доски;
сковороды; весы лабораторные; электроплитка; баня водяная; мерные
пипетки на 1-2 мл; мерные цилиндры на 10 мл; конические колбы с
притертой пробкой фотоэлектрокалориметр (спектрофотометр);
гексан; хлороформ; ледяная уксусная кислота; насыщенный раствор
йодистого калия; 1% раствор крахмала; 0,01 н. раствор тиосульфата
натрия.
54
Ход работы
X =
D×100
C×119
K,
Y =
D×100
C×109,5
K,
1. Приготовление образцов для проведения анализа. Картофель
измельчить ножом, морковь измельчить на терке, взять навеску 50 г,
залить 150 г подсолнечного масла. Поместить на сковороду и
проводить обжаривание овощей в течение 40–60 минут, периодически
помешивая. Через каждые 20 минут производить отбор проб
растительного масла по 5 мл.
2. Определение содержания изомеров жирных кислот с
сопряженными двойными связями. Для определения содержания
диеновых (с двумя сопряженными связями) и триеновых (с тремя
сопряженными связями) соединений 0,1 г пробы растительного масла
растворяют в небольшом количестве гексана и разводят до
концентрации 1 г/100мл. Затем проводят определение оптической
плотности раствора на фотоэлектрокалориметре со светофильтрами,
дающими длины волн 230 нм и 268 нм.
Содержание соединений диеновых в пересчете на транси-
золинолевую кислоту, и триеновых в пересчете на трансизолинолевую
кислоту вычисляют в % по формуле:
где D – оптическая плотность испытуемого раствора (среднее из
двух параллельных определений) ед. прибора;
C – концентрация раствора, г/л;
119 и 209,5 – средние значения коэффициента поглощения
трансизолинолевой кислоты при длинах волн 230 нм и 268 нм
соответственно;
K – коэффициент пересчета, равный 58.
3. Определение перекисного числа масла. Метод состоит в том,
что в результате действия перекисей на KI, выделяется йод, который
оттитровывается тиосульфатом натрия. Реакцию проводят в кислой
среде, используя уксусную кислоту (как устойчивую к окислению) и
водный раствор KI. При этом образуется HI, реагирующая с
перекисями, и выделяется свободный йод:
55
KI+ CH3COOH → HI + CH3COOK,
,
10000127,0)(
q
дба
ПЧ
CH3(CH2)6CHOOH-CH=CH(CH2)7COOH+ HI →
гидроперекись олеиновой кислоты
→ CH3(CH2)6CHOH-CH=CH(CH2)7COOH+I2+H2O.
Выделившийся йод оттитровывают тиосульфатом натрия в
присутствии крахмала:
I2+2Na2S2O3→2NaI+Na2S4O6.
В коническую колбу с притертой пробкой вносят навеску жира
0,8 г, взятую с точностью до 0,0001 г. Жир расплавляют на водяной
бане и по стенке колбы, смывая следы жира. Вливают из мерного
цилиндра 10 мл хлороформа для растворения жира, 10 мл ледяной
уксусной кислоты, 0,5 мл насыщенного свежеприготовленного
раствора KI. Закрывают пробкой колбу, перемешивают содержимое и
ставят в темное место на 5 минуты. Затем вливают 100 мл
дистиллированной воды, в которую заранее добавляют 1 мл
1% раствора крахмала. Титруют полученную смесь 0,01н. раствором
тиосульфата натрия до исчезновения синей окраски. Для проверки
чистоты KI проводят контрольное определение (без жира) и, в случае
выделения йода, последний титруют тиосульфатом натрия. Реактив
пригоден, если на титрование идет не более 0,07 мл 0,01н. раствора
тиосульфата.
Перекисное число жира определяют по формуле:
где а, б – объемы раствора тиосульфата натрия, пошедшие на
титрование, соответственно опыта и контроля, мл;
д – коэффициент поправки к раствору 0,01 н. раствора
тиосульфата натрия, равный 1;
q – навеска жира, г;
0,00127 – количество граммов йода, эквивалентное 1 мл 0,01 н.
раствора тиосульфата натрия.
56
2. СТРЕСС И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА
Стресс испытывают все формы жизни, если условия, в которых
они обычно существуют, резко изменяются. Стресс ‒ это
интегральный (лат. integer ‒ цельный, единый) неспецифический ответ
организма на повреждающее действие, направленный на выживание
его за счет мобилизации и формирования защитных систем [6].
Если повреждающее действие стрессора превосходит защитные
возможности организма, то наступает смерть – можно говорить об
экстремальном факторе. В дальнейшим, применяя понятие организма,
в теории стресса будут подразумеваться не только высшие животные,
микроорганизмы, а также растения.
Основные понятия и положения учения о стрессе разработаны в
1936 г. канадцем Гансом Селье [9]. По Г. Селье, стресс - совокупность
всех неспецифических изменений, возникающих в организме под
влиянием любых неблагоприятных и повреждающих факторов
(стрессоров). Селье полагал, что адаптивная реакция организма на
различные неблагоприятные факторы (стрессоры) развивается по
единому сценарию.
Комплекс ответных реакций организма на стрессоры Г. Селье
назвал «генерализованным адаптационным синдромом» и выделил в
нем 3 стадии – триады (рис. 14) [8]:
1) тревога и торможение большинства процессов;
2) адаптация, в течение которой организм приспосабливается к
стрессору;
3) истощение, если адаптивный потенциал организма
недостаточен для преодоления влияния стрессора.
На протяжении триады формируется неспецифическая резистентность (устойчивость), но при увеличении силы эффекта и
исчерпании защитных возможностей организма наступает его гибель.
Г. Селье разделил стресс на положительный стимуляционный
(эустресс) и патологический (дистресс). Граница между эустрессом и
дистрессом расплывчата и зависит от дозы воздействия и исходной
устойчивости организма [5].
На фазе тревоги, спешно активируются гены, обеспечивающие сопротивление стресс-фактору (стрессору), тормозятся процессы транскрипции и репликации; синтезируется ряд стрессовых
белков.
57
Рис. 14. «Триада Селье» и фаза репарации: I – фаза тревоги;
II – фаза адаптации; III – фаза истощения; IV – фаза репарации
В ходе второй фазы у микроорганизмов на основании
изменений, произошедших во время первой фазы, включаются
главные механизмы адаптации, энергетические затраты достигают
своего максимума.
Адаптация бактерий к неблагоприятным условиям среды
является традиционным и хорошо изученным разделом биохимии и
микробиологии. Под адаптацией (лат. adaptio – приспособление)
понимают сумму физиологических, биохимических, морфологических
и поведенческих реакций организма, направленных на изменение
скорости роста, метаболизма, жизнеспособности (выживаемости),
генетически присущих организму. Адаптация направлена на
выживание конкретной популяции и всего вида в целом.
На стадии истощения, в условиях возрастания силы эффекта и
постепенного исчерпания защитных возможностей организма, также
доминируют неспецифические реакции, происходит разрушение
внутриклеточных структур. Эта фаза характеризуется энергетическим
дефицитом и извращенным метаболизмом. Эти сдвиги свидетельствуют о сильных, необратимых повреждениях клетки.
Некоторые исследователи предлагают дополнить триаду Селье
еще одной фазой – четвертой, назвав ее фазой регенерации
(реституции), наступление которой возможно после удаления
стрессора. Данный этап не может быть повторением второй фазы,
58
поскольку к этому времени организм оказывается слишком
ослабленным [5].
Смертоносны для организма первая и особенно последняя фаза.
Стрессорные факторы, или стрессоры, могут иметь химическую,
физическую или биологическую природу. Сам организм может быть
источником стрессорных факторов. Например, при нормальном
метаболизме многие бактерии образуют Н2О2, супероксидные
радикалы О
∙−
и другие активные формы кислорода. Под действием
2
стрессов происходит избыточное накопление данных активных форм
кислорода, что приводит к денатурации белков, разрыву нуклеиновых
кислот, окислению макромолекул и другим повреждениям.
Практически любое стрессовое воздействие на организм
провоцирует возникновение в его клетках окислительного стресса.
Можно сказать, что окислительный стресс – главный стресс живых
систем. Это происходит вследствие того, что стрессоры разной
природы являются причиной нарушений в нормальном функционировании организма, изменяя энергозависимые пути метаболизма.
При действии стрессоров равновесие окислительно-восстановительных реакций смещается, происходить образование и накопление
свободных радикалов, прежде всего активных форм кислорода.
Причиной повреждения нуклеиновых кислот, разрыва и сшивки
белковых молекул, блокада реакционных центров ферментов и общего
истощения организма является не сам кислород, а именно активные
формы кислорода. Повышение концентрации АФК до уровня,
вызывающего окислительный стресс, может происходить в результате
нарушения нормального метаболизма при экстремальных воздействиях [20]. В клетках аэробных организмов не менее 95% потребляемого кислорода восстанавливается митохондриальной цитохромоксидазой, а остальная часть – многочисленными ферментами,
относящимися к оксидазам и аэробным дегидрогеназам. Для полного
восстановления кислорода необходим одновременный перенос на
молекулу О2 четырех электронов с образованием двух молекул воды
или эквивалентных соединений.
Поскольку воздействие любого стрессора приводит в конечном итоге к окислительному стрессу, рассматривать последствия
стрессов на клетку следует с позиции повреждений, вызываемых АФК.
Повреждения, индуцируемые АФК. Избыточная генерация АФК
может приводить к атаке и повреждению всех клеточных и
59
экстраклеточных компонентов. Однако наиболее существенно то, что
АФК являются короткоживущими формами и в основном повреждают
структуры, расположенные поблизости от места их генерации.
Рассмотрим наиболее подробно клеточные мишени АФК:
− Липиды биологических мембран. Полиненасыщенные жирные
кислоты, входящие в состав клеточных мембран (как наружной, так и
метохондриальной), являются основной мишенью АФК. Перекисное
окисление липидов – одна из наиболее исследованных областей
действия АФК. Вследствие наличия сопряженных двойных связей
полиненасыщенные жирные кислоты являются легкой добычей для
радикальной атаки. Особенно эффективно действует гидроксидрадикал, вызывая перекисное окисление липидов. Раз начавшись, этот
процесс развивается как цепная реакция, генерируя гидроперекиси и
альдегиды, так что даже единичный радикальный акт может повредить
множество липидных молекул. Накопление гидроперекисей
модифицирует микровязкость мембран, активность трансмембранных
ферментов, переносчиков и других мембранных белков. В итоге
процессы перекисного окисления липидов вызывают изменения в
мембранной проницаемости и селективности.
Перекисное окисление липидов существенно ускоряется, когда
система клеточной детоксикации АФК не в состоянии удалить
предшественников гидроксил-радикала, главным образом, пероксид
водорода. Даже по своей инициации перекисное окисление липидов
может быть успешно подавлено такими антиоксидантами, как витамин
Е, хотя показано, что NO также может выступать в качестве
антиоксиданта против этого процесса. Это свойство NO объясняет его
защитное действие против окислительного повреждения.
– Белки. Это наиболее широко распространенные компоненты
клетки, которые делают ее легкой добычей АФК. Более того,
относительно небольшие структурные модификации единичных
белков могут приводить к заметным изменениям клеточной
активности.
Как было показано, АФК способны реагировать с различными
аминокислотами, вызывая как ослабление активности белка, так и
полную утрату его функциональных проявлений. Гидроксид-радикал,
по-видимому, является наиболее эффективным агентом, вызывающим
окислительное повреждение белковой молекулы. Окисление белка
приносит в его структуру новые функциональные группы, как,
например, гидроксильные или карбонильные, которые приводит к
60
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]