Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Химия биологически активных веществ. Учебное пособие
.pdf
Набор
гребенок
Камера
Крышка с
электродами
Рис. 4. Составные части электрофоретической камеры
стеклом, так чтобы спейсер создавал зазор между стеклами, при этом
края стекол должны быть выровнены относительно друг друга.
поместить их на заливочный столик.
оставить на 40 минут для полимеризации.
Рис. 5. Набор стекол с фиксированными спейсерами
Собрать камеру для электрофореза:
1. Соединить стекло с фиксированными спейсерами с обычным
2. Закрепить стекла с помощью механизма для зажима и
3. Залить пробку (небольшое количество).
4. Затем залить разделяющий гель. Сверху наслоить воду и
5. Поставить гребенку и залить формирующий гель.
21
6. Убрать гребенку, промыть образовавшиеся кармашки
Реактив
Количество вещества, мл
на 2 мл пробки
на 1 мл пробки
Раствор stok
1,1
0,55
Раствор Трис, pH 8.8
0,38
0,19
Раствор ДСН
6 мкл
3 мкл
Деионизованная вода
0,52
0,26
TEMЭД
20 мкл
10 мкл
Раствор ПСА
20 мкл
10 мкл
буфером и заполнить их исследуемым препаратом.
7. Загрузить стекла с гелем и препаратами в электро-
форетическую камеру, заполнить ее буфером.
Электрофорез проводили в 10% полиакриламидном геле (ПААГ)
c додецилсульфат. Для приготовления гелей использовали:
stock раствор, содержащий 30% акриламида и 1%
NN`-метиленбисакриламида в бидистилляте;
2 М раствор Триса (рН 8.8). Навеску реактива 12,11 г
растворяли в ~ 40-45 мл бидистилята, доводили рН раствора до 8.8
концентрированной НCI. Объем раствора доводили до 50 мл, после
чего фильтровали;
раствор ДСН. 25 г растворяли в 50 мл бидистилляте с
последующим доведением объема раствора до 100 мл;
тетраметилэтилендиамин (ТЕМЭД). Данный реактив добавля-
ем непосредственно перед заливкой геля в камеру в количестве,
указанном в таблицах 4-6;
~10% раствор персульфата аммония (ПСА): 100 мкг ПСА
растворяли в 1 мл бидистиллята. Раствор используют непосредственно
перед заливкой геля в камеру в количестве, указанном в табл. 4-6.
Условия приготовления необходимых объемов соответствующих гелей обобщили в табл. 4-6.
Таблица 4. Состав пробки
22
Таблица 5. Состав разделяющего 6 % геля
Реактив
Количество вещества, мл
на 7,5 мл геля
на 3 мл геля
Раствор stok
1,5
0,6
Раствор Трис рН 8.8
1,4
0,56
Раствор ДСН
30 мкл
12 мкл
Деионизованная вода
4,11
1,644
TEMЭД
4 мкл
1,6 мкл
Раствор ПСА
10 мкл
4 мкл
Реактив
Количества вещества, мл
на 2 мл геля
на 5 мл геля
Раствор stok
0,27
0,67
Раствор Трис рН 6.8
0,17
0,42
Раствор ДСН
5,3 мкл
13 мкл
Деионизованная вода
0,893
3,2
TEMЭД
2,7 мкл
6,3 мкл
Раствор ПСА
9,3 мкл
23,3 мкл
Реактив
Количество вещества (г) на 500 мл
раствора
Трис
15,1 г
Глицин
72,1 г
ДСН
5 г
Таблица 6. Состав формирующего геля
В таблице 7 приведены условия приготовления концентрированного раствора электродного буфера. При проведении электрофореза
его разбавляли в 10 раз.
Таблица 7. Состав концентрированного раствора электродного
буфера
Электрофорез проводили при силе тока 10-20 мА и напряжении
10-20 В.
После того, как фронт красителя подойдет к нижнему краю
пластины (рис. 6), прибор отключают от электропитания, гель
осторожно вынимают из стекол. Линейкой измеряют расстояние от
верхней границы разделяющего геля до границы бромфенолового
синего.
23
Реактив
Количество вещества (мл)
на 250 мл раствора
Кумасси
0,25 г
Уксусная кислота
25
Этиловый спирт
62,2
Рис. 6. Гель с границей бромфенолового синего
после окончания электрофореза
После окончания электрофореза гель фиксировали в течение
10 минут в растворе этанола, смешанного в соотношении 1:1 с
бидистиллятом. После этого белковые зоны окрашивали ярко синим
раствором кумасси R-250 в течение 12-16 часов (табл. 8) в
естественных условиях.
Таблица 8. Состав раствора Coomassie R-250
Отмывку геля от излишков краски проводили в два этапа:
сначала отмывали 5 минут в дистиллированной воде, затем в
отмывающих растворах, составы которых приведены в таблицах 9–10.
Гель отмывали до прозрачности.
24
Таблица 9. Состав отмывающего раствора I
Реактив
Количество вещества (мл)
на 500 мл раствора
Этиловый спирт
200
Уксусная кислота
35
Дистиллированная вода
265
Реактив
Количество вещества (мл)
на 500 мл раствора
Этиловый спирт
125
Уксусная кислота
50
Дистиллированная вода
325
Таблица 10. Состав отмывающего раствора II
Обработка результатов. Гель окрашенный Кумасси R-250
(электрофореграммы, рис. 7) сканировали при помощи Epcan Scan.
Обработка экспериментальных данных осуществлялась с
использованием программ Excel и Scion Image [6].
Рис. 7. Электрофореграмма белков коровьего молока
По полученным данным строили денситограммы (рис. 8), где
каждый пик соответствует определенному белку.
25
Электрофоретическая подвижность разделяемых полипептидов
u = A - B×lgMr,
20
66
Мм, кДа
24
14,2
45
36
убывает с возрастанием логарифма их молекулярной массы:
где А и В – коэффициенты, зависящие от пористости геля,
температуры и других условий эксперимента.
одновременно с исследуемой смесью электрофоретическому
разделению подвергают набор белков-«маркеров», молекулярные
массы которых точно известны. Для удобства электрофоретическую
Рис. 8. Денситограмма полипептидного состава исходного
коровьего молока
Определяем молекулярную массу выявленных белков.
Коэффициенты А и В определяют экспериментально. Для этого
26
подвижность представляют в относительных единицах - в значениях
величины Rf, рассчитываемых путем деления длины пути, пройденного за время электрофореза данным белком, к длине пути,
пройденного лидирующим красителем (бромфеноловым синим).
Измерив длину пути, пройденного при электрофорезе лидирующим
красителем и каждым из маркеров, рассчитывают значения их Rf.
Затем, зная молекулярные массы маркеров, строят экспериментальную
зависимость lgMr от Rf. Если пористость геля выбрана правильно, то
такая зависимость будет линейной. Рассчитав Rf для интересующего
нас белка, по графику находят для него величину lgMr и рассчитывают
Mr (рис. 9).
Рис. 9. Зависимость между молекулярной массой и относительной
подвижностью белка при гель-электрофорезе в ПААГ в присутствии
SDS (в полулогарифмической системе координат): 1 – фосфорилаза В,
97400 Да, lgMr = 4,99 2 – бычий сывороточный альбумин, 68 000 Да,
lgMr = 4,83; 3 – яичный альбумин, 45000 Да, lg Mr = 4,65;
4 – карбоангидраза, 31000 Да, lg Mr = 4,49 5 – соевый белок –
ингибитор трипсина, 21500 Да, lg Mr = 4,33; 6 – лактальбумин,
14500 Да, lg Mr = 4,16
27
Молекулярная масса исследуемого полипептида оказалась
Белок
Содержание, % от
общего количества
белков молока
Молекулярная
масс, кДа
Казеины:
78-85
αs - казеины
45-55
22-24
β - казеины
25-35
24
χ - казеины
8-15
19
γ - казеины
3-7
12-21
Сывороточные белки:
15-22
β – лактоглобулин
7-12
18
α – лактальбумин
сыворотки крови
2-5
14
иммуноглобулины:
1,9-3,3
ИгG
1,4-3,3
150-163
ИгА
0,2-0,7
400
ИгМ
0,1-0,7
1000
протеозо-пептоны
2-6
4-41
равной 36,5 кДа (lg 4,56)
По молекулярной массе выявленных белков молока проводили
их идентификацию по справочным данным, представленным в
табл. 11.
Таблица 11. Молекулярная масса белков молока
Двумерный электрофорез (2Д-электрофорез) белков. Учитывая, что протеом различных объектов исследования имеет сложный
состав (сложность конфигурации соответствующих пиков на
денситограммах рис. 12) благодаря присутствию генетических
вариантов, посттрансляционных модификаций белков и процессов
протеолиза, для его изучения необходимо использовать метод с
высокой разрешающей способностью. Это позволяет осуществить
метод двумерного электрофореза, который является наиболее
эффективным.
28
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 50 100 150 20 0 250
664536
29
242014,2
Мм, кДа
А
Рис. 12 Денситограмма полипептидного состава
исходного коровьего молока
Двумерный электрофорез (2DE – two dimensional electrophoresis)
представляет собой метод разделения смеси белков, основанный на
последовательном использовании двух свойств белков: заряда и
массы. Использование таких не связанных между собой свойств
белков необходимо, чтобы разделение смеси белков было
максимальным.
29
При исследовании белков методом 2Д-электрофореза, целью
исследования является:
- обеспечить воспроизводимое разделение основных известных
белков;
- показать присутствие известных минорных белков;
- выявить и идентифицировать маркерные белки.
Для достижения целей решаются следующие задачи:
1. Все белки, содержащиеся в изучаемом образце, подвергаются
солюбилизации и становятся объектами анализа.
Солюбилизация – это самопроизвольное и обратимое
проникание какого-либо низкомолекулярного вещества (солюбилизата), слабо растворимого в данной жидкой среде, внутрь находящихся
в ней мицелл поверхностно-активного вещества или молекулярных
клубков (глобул) высокомолекулярного соединения.
2. Проводится аналитическое фракционирование по двум
независимым друг от друга физико-химическим свойствам
полипептидных цепей, отражающих особенности их первичной
структуры; комбинированное использование:
- изоэлектрофокусировки (ИЭФ), обеспечивающей фракцио-
нирование по изоэлектрической точке белка pI,
- электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в
присутствии додецилсульфата натрия (ДДС-Na), обеспечивающего
разделение белков по молекулярной массе.
3. Выявление белковых фракций после разделения с помощью
высокочувствительных методов детекции белков (различные
модификации масс-спектрометрии).
4. Стандартизированное описание белков на двумерных
электрофореграммах в системе прямоугольных координат, в которых
одна из координат является функцией молекулярной массы, а другая –
изоэлектрической точкой для каждого вида полипептидных цепей [11].
Лабораторная работа 3
Разделение белков по размерам и заряду
В этом случае в электродных резервуарах и для полимеризации
ПААГ используют один и тот же буфер, поэтому такую систему
иногда называют непрерывной, или простой. Строго говоря,
непрерывность нарушается тем, что буфер, в котором вносят белковый
30
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]