Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Химия биологически активных веществ. Учебное пособие
.pdf
препарат, с целью концентрирования исходной зоны разбавляют в
5-10 раз водой.
Для обеспечения хорошей электрофоретической подвижности и
сохранения вместе с тем ощутимых различий в суммарных
электрических зарядах белков выбирают рН буфера.
Для кислых белков часто используют буфер с рН 8,9, для
щелочных – с рН 4,3-4,5. В качестве слабощелочных буферов для
кислых белков применяют Трис-HCl, Трис-глициновый, Трисборатный или Трис-барбитуратный. Для щелочных белков чаще всего
используют К-ацетатный и Трис-ацетатный буферы.
Для предотвращения агрегации белков в рабочий буфер геля
нередко вводят мочевину в концентрации от 2 до 8М. Ее, разумеется,
добавляют и в исходный белковый препарат. В электродные буферы
вносить мочевину не нужно, так как, не будучи заряженной, она не
мигрирует в геле, а, следовательно, и не нуждается в пополнении. На
электропроводности буфера присутствие мочевины практически не
сказывается.
В концентрированных растворах мочевины происходит
денатурация белков, часть дисульфидных мостиков рвется и
полипептидная цепочка, утратив вторичную структуру, ведет себя как
хаотический клубок. Денатурация не является полной и может быть
обращена.
Следует всегда иметь в виду возможность частичного
разложения мочевины с образованием циановой кислоты и
карбамоилирования белков. Это особенно относится к долго хранящимся буферам, поэтому лучше добавлять сухую мочевину в буфер
непосредственно перед приготовлением геля.
Для приготовления геля с высоким содержанием мочевины ее
добавляют во все маточные растворы.
Для наблюдения за ходом электрофореза в исходный препарат
вносят краситель, мигрирующий в том же направлении, что и
фракционируемые белки. Он не должен заметным образом
связываться с белками, а скорость его продвижения по гелю должна
быть заведомо больше, чем у наиболее быстро мигрирующего белка.
Вместе с тем краситель не должен слишком сильно отрываться от
белков, чтобы его прохождению до конца пластины или трубки
соответствовало использование большей части находящегося в них
геля для фракционирования белков. Быть может, по ассоциации с
31
велосипедными гонками за лидером, этот краситель называют
лидирующим.
В щелочных и нейтральных буферах, когда кислые белки
заряжены отрицательно и мигрируют к аноду, а также для любых
белков в комплексе с додецилсульфат натрием (ДДС) используют
отрицательно заряженные красители. Наибольшее распространение
получил бромфеноловый синий, имеющий достаточно сложную
структуру; в его состав, в частности, входят два дибромфенольных
остатка. Иногда используют еще более сложно построенный краситель – ксиленцианол, электрофоретическая подвижность которого
примерно вдвое ниже, чем бромфенолового синего, поэтому его
используют при фракционировании крупных белков [21].
Для характеристики электрофоретической подвижности белка в
данных условиях электрофореза принято указывать отношение
расстояния, пройденного белковой полосой от начала рабочего геля, к
аналогичному расстоянию до полосы красителя в этом же геле. Это
отношение, как и в хроматографии, обозначают Rf.
В качестве положительно заряженного красителя для
электрофореза в кислой среде, когда белки мигрируют в направлении
катода, используют метиловый зеленый или пиронин.
Что касается белкового препарата, то его растворяют в том же
рабочем буфере, но меньшей концентрации (в 5-10 раз). Если
электрофорез идет в присутствии мочевины, то ее концентрация в
разбавленном буфере должна быть такой же, как в рабочем буфере
геля.
Иногда проводят предварительное полное восстановление белка
путем прединкубации его в течение ночи при комнатной температуре
в буфере с рН 8,5-9, содержащем 0,1 М β-меркаптоэтанола и 9 М
мочевины (щелочное значение рН буфера способствует
восстановительному эффекту β-меркаптоэтанола).
В раствор препарата добавляют до 10% глицерина или сахарозы,
чтобы облегчить его подслаивание под электродный буфер. Наконец, в
препарат вносят еще и краситель, например бромфеноловый синий до
концентрации 0,01%. Миграция этой «лидирующей» зоны до конца
геля определяет момент окончания электрофореза. Заметим кстати,
что при последующей фиксации белков бромфеноловый синий
обесцвечивается [25]. Во втором направлении осуществляем
электрофорез по молекулярной массе с использованием додецил
сульфат натрия.
32
Ход работы
Реактив
Количество вещества (мг)
на 10 мл раствора
Мочевина
4,8 г
ДТТ
46,3
Трис
24,2
Бромфеноловый синий
1 мкл
Глицирин
0,5 мл
Одномерный электрофорез по заряду. При проведении данного
электрофореза меняется состав буфера для приготовления белкового
препарата. Его состав приведен в табл. 12.
При приготовлении раствора буфера первоначально добавляем
навеску мочевины 4,8 г в ~ 6-7 мл бидистиллята, нагреваем на водяной
бане (t
~ 35 0С) до растворения мочевины, затем добавля-
бани
ли остальные компоненты. После чего доводили рН раствора до
8.7 слабоконцентрированным раствором НСI, которого готовили
разбавлением концентрированной НСI бидистиллятом в соответствии 1:1. Доводили объем буфера до 10 мл бидистиллятом.
Таблица 12. Состав буфера (рН 8.7) для подготовки белкового
препарата при одномерном электрофорезе по заряду
После растворения белка приготовленные пробы хранили при
-20 0С не более 2 недель.
Для проведения электрофоретического разделения белков по
заряду были использованы ПААГ. В отличие от электрофореза по
Лэммли, данные гели должны сдержать 8-10 М мочевину.
Раствор 10 М мочевины для приготовления гелей готовили
следующим образом: навеску мочевины массой 2,4 г растворяли
в 2,5 мл бидистиллята с обязательным нагревом на водяной бане
(t
~ 35 0С), после чего объем раствора доводили бидистиллятом до
бани
4 мл.
Состав гелей приведен в таблицах 13, 14.
33
Таблица 13. Состав пробки объемом 1 мл
Реактив
Количество вещества, мл
Раствор stock
0,55
Раствор Трис рН 8.8
0,19
Раствор мочевины 10М
0,24
TEMЭД
10 мкл
Раствор ПСА
10 мкл
Реактив
Количество вещества, мл
Раствор stock
1,2
Раствор Трис рН 8.8
1,12
Раствор мочевины 10М
3,65
TEMЭД
6,4 мкл
Раствор ПСА
16 мкл
Глицин
72,1 г
Таблица 14. Состав 6 % геля объемом 6 мл
После проведения электрофореза из геля вырезали необходимые
треки, помещали их в планшеты и промывали 2 раза по 5 минут в 5 мл
бидистиллированной воды для отмывки их от мочевины. Затем треки
заливали 3 мл раствора sampol-буфера и качали 20 минут. После чего
проводили электрофорез с додецил сульфат натрием без
формирующего геля. Вместо него на разделяющий гель наслаивали
электродный буфер и помещали вырезанный трек. Затем буфер
аккуратно сливали таким образом, чтобы между разделяющим гелем и
вырезанным треком не образовывались пузырьки воздуха. На уровне
трека помещали кармашек для маркеров и заливали 6% гель и
проводили электрофоретическое разделение.
Обработка результатов. Гель окрашенный кумасси R-250
сканировали при помощи Epcan Scan. Обработка экспериментальных
данных осуществлялась с использованием программ Scion Image и
Excel, как в предыдущей работе.
34
Лабораторная работа 4
Двумерный электрофорез по изоэлектрической
точке и молекулярной массе
Изоэлектрофокусированием называют разработанный в начале
60-х годов метод разделения белков под действием электрического
поля в среде с градиентом рН, который создается специальными
амфотерными веществами – «амфолитами», способными переносить
ток, а также создавать и переносить рН.
Появление наборов полиаминополикарбоновых кислот (амфолинов) обеспечило высокую эффективность фракционирования белков
с помощью ИЭФ, при этом разделение осуществлялось за счет
различий pI [11].
Во время изоэлектрофокусирования между анодом и катодом
создается градиент рН. Заряженные молекулы, которые вначале
равномерно распределены в среде, движутся в соответствии с их
фактическим зарядом в направлении противоположно заряженного
электрода. Если эти молекулы амфотерны, то при перемещении в
градиенте рН их суммарный заряд будет непрерывно меняться до тех
пор, пока они не достигнут положения, где он станет равным нулю.
Это произойдет в том месте градиента рН, в котором значение рН
окажется равным изоэлектрической точке молекулы.
Изоэлектрическая точка – значение рН, при котором суммарный
заряд белковой молекулы равен нулю, и, следовательно, белок не
способен перемещаться под действием электрического поля. Таким
образом, под действием электрического поля каждый белок
перемещается в ту зону градиента, которая соответствует его
изоэлектрической точке и остается в ней [9]. Далее осуществляют
второй этап двумерного электрофореза.
Подготовка белкового образца для электрофоретических
исследований. Осаждение белка осуществляли в эпиндорфах,
добавляя захоложенный ацетон (t = -20 0С) к пробе молока в
соотношении 2:1 соответственно (400 мкл ацетона и 200 мкл молока).
Эпиндорфы закрывали, встряхивали и помещали в морозильную
камеру на час (можно оставлять на более длительное время, даже на
ночь). Затем центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 мин.
Фугат осторожно сливали, вносили в эпиндорфы 400 мкл
захоложенного ацетона, перемешивали и снова центрифугировали.
35
Эту операцию повторяли 4 раза, после чего осадок белка сушили под
Реактив
Концентрация
веществ в конечном
растворе
Навески веществ
для приготовления
раствора, 20 мл
Мочевина
8 М
9,6 г
Тиомочевина
2 М
3 г
IPG-буфер
0,2 %
200 мкл
СHAPS
4 %
800 мг
DТТ
30 мМ
92,6 мг
TRIS
20 мМ
48,4 мг
тягой (30–40 мин). Затем белок растворяли в буфере (таблица 15) до
необходимой конечной концентрации (мг/мл). Образцы окрашивали
бромфеноловым синим до появления голубовато-синего оттенка и
проводили электрофоретические определения. Полученные образцы
хранили при температуре - 20 0С, не более двух недель.
Таблица 15. Состав лизирующего буфера
2D-электрофорез. Изоэлектрофокусирование (ИЭФ) проводили
с помощью самостоятельно изготовленных гелей в стеклянных
трубочках размером 1,0×180 мм. При подготовке четырех гелей
(1,0×180 мм) для разделения белков по изоэлектрической точке
требуется 2 мл раствора, содержащего 30% акриламида, 1%
бисакриламида, 8 М мочевины, 1% амфолитов, 2% СHAPS (хранится в
морозильной камере), 105 мкл раствора амфолитов (рН 3-10), 680 мкл
бидистилированной воды.
После растворения мочевины раствор дегазировали с помощью
вакуумного насоса. После дегазации добавляли 2 мкл ТЕМЭД и 4 мкл
свежеприготовленного раствора 10% ПСА для инициации
полимеризации. Стеклянные трубочки с 1 конца закрывали пленкой
Parafilm, устанавливали манжету и ставили в штатив. Выровняв
нижний конец трубочек по срезу выреза камеры. В трубочки с
помощью шприца заливали приготовленный раствор, не допуская
образования воздушных пузырьков, а затем оставляли для
полимеризации. После завершения полимеризации снимали с
трубочек Parafilm. Гели использовались в тот же день (чтобы избежать
возможности разрушения мочевины в геле). Нижний конец трубочки
заполняли 20 мМ раствором Н3PO4 . Трубочки устанавливали в штатив
36
камеры. Сверху на гель в трубочке шприцом наносили пробу
Реактив
Концентрация
веществ
в конечном
растворе
Навески
веществ для
приготовления
раствора, 100 мл
Навески
веществ для
приготовления
раствора, 50 мл
Мочевина
6М
36 г
18 г
Трис, pH 8.8
0,375М
3,35 мл
1,675 мл
ДСН
2%
2 г
1 г
Глицерин
30%
34,5 мл
17,25 мл
белкового образца, затем аккуратно наслаивали верхний электродный
буфер (50 мМ NaOH) до края трубочки, не допуская перемешивания
пробы и буфера. Необходимо следить за тем, чтобы в трубочке не
оставалось пузырьков воздуха, поскольку они мешают прохождению
электрического тока.
В нижнюю часть камеры заливали нижний электродный буфер
(20 мМ Н3PO4), а в верхнюю часть камеры – верхний электродный
буфер. При этом верхний и нижний конец трубочек были погружены в
соответствующие буферы. Необходимо следить, чтобы верхний и
нижний буферы не смешивались, поскольку они мешают
прохождению электрического тока.
Фокусировку проводили на приборе GEL ELECTROPHORESIS
APPARATUS XE MIMIFIL 8S. Пробы фокусировали по следующей
программе 1 час при 100В, 1 час при 200В, далее каждый час
повышали напряжение на 100В, до достижения 700В (напряжение
постоянное). Сила тока не должна превышать 0,7 мА.
После фокусировки гель из трубочек осторожно выдавливали на
планшет шприцом (создавая давление на одном из концов трубочки) с
помощью эквилибрирующего буфера (таблица 16).
Таблица 16. Состав уравновешивающего буфера
Сверху на каждый гель наслаивали 2,5 мл эквилибрирующего
буфера с 1 % ДТТ (если проба не используется сразу после
фокусировки, их можно хранить при -20 0С в течение недели, без
потери качества разделения, перед использованием замороженные
гели нужно выдержать при комнатной температуре в течение
10 мин.) и инкубировали в нем 10 мин. Затем проводили разделение во
втором направление как описано в лабораторной работе 1.
37
Обработка результатов. Гель, окрашенный кумасси R-250
сканировали при помощи Epcan Scan. Обработка экспериментальных
данных осуществлялась с использованием программ Scion Image,
Photoshop и Fliker [29].
Лабораторная работа 5
Определение изоферментных спектров пероксидазы
Определение активности изоферментов пероксидазы проводилось согласно Ермакову с соавторами (1987). Визуализация изоформ
происходит в виде синих полос на прозрачном геле, проявляющихся за
счет образования окрашенного продукта реакции в месте окисления
бензидина в присутствии пероксидазы.
Необходимые реактивы
1) 0,5 % уксусная кислота: 1 мл ледяной уксусной кислоты
добавить к 49 мл дистиллированной воды.
2) Tpис-глициновый буфер рН 8.3: Трис - 0,6 г; глицин - 2,34 г,
борная кислота - 0,1 г, растворить в 1 л дистиллированной воды.
3) Бензидиновый реагент: 125 мг основного или солянокислого
бензидина растворить в 1 мл ледяной уксусной кислоты и после полного растворения довести объем до 50 мл дистиллированной водой.
4) 0,1 % водный раствор перекиси водорода: 0,5 мл аптечной
перекиси водорода (3%) добавить к 14,5 мл дистиллированной воды.
Ход работы
Для исследования пероксидазной активности берут корни гороха
массой 200-300 мг, которые растирают в холодной фарфоровой ступке
холодным пестиком с 0,5 мл ацетатного буфера (рН 5,0).
Полученный гомогенат центрифугируют в течение 5 мин при
12000 g. Пробы помещают в холодильник при +4 °С.
Обязательно определяют содержание белка в пробе. Для
проведения гельэлектрофореза пробы выравнивают по содержанию
белка (обычно около 10 мкг).
Гельэлектрофорез проводят в 10% полиакриламидном геле в
неденатурирующих условиях согласно методике Laemly (как описано
38
в лабораторной работе 1), исключая ДСН из всех растворов.
Разделение проводят, выставляя напряжение из расчета 2 В/см2, в
качестве электродного буфера использовали Трис-глициновый рН 8.3
с добавлением борной кислоты до конечной концентрации 0,1 %.
После проведения гельэлектрофореза гель помещают на
5-10 минут в раствор 0,5% уксусной кислоты. Затем уксусную кислоту
удаляют, и гель заливают свежеприготовленным бензидиновым
реагентом и оставляют на шейкере на 20 минут.
Далее бензидиновый реагент удаляют и гель 1 раз споласкивают
раствором уксусной кислоты. После этого гель заливают 0,1 % водным
раствором перекиси водорода и фиксируют появление изоформ (синих
полос) пероксидазы (рис. 13).
Рис. 13. Результат проявления электрофореграмм
на пероксидазную активность
Ненасыщенные жирные кислоты
В природе обнаружено более 200 жирных кислот. Однако
широкое распространение имеют не более 20, которым присущ ряд
общих свойств и особенностей.
Жирные кислоты, входящие в состав липидов высших растений
и животных, – это монокарбоновые кислоты, содержащие линейные углеводородные цепи (обычно С12-С20) общей формулы
СН3 (СН2)nСООН.
Жирные кислоты, входящие в состав жиров, содержат четное
число атомов углерода. Однако в природе, хотя и редко, встречаются
также кислоты с нечетным числом углеродных атомов. В липидах
39
содержатся кислоты как насыщенные, так и с одной или несколькими
0
12
С
0
14
С
0
16
С
0
18
С
0
20
С
1
18
С
2
18
С
3
18
С
ненасыщенными (этиленовыми) связями. Они всегда разделены одной
метиленовой группой:
-СН = СН-СН2-СН =СН-
Наряду с наиболее часто встречающимися в составе жиров
насыщенными жирными кислотами: лауриновой (
(
); пальмитиновой (
); стеариновой (
); арахиновой (
); миристиновой
); в
их состав входят также и ненасыщенные - олеиновая (
(
) и линоленовая (
). Полиненасыщенные жирные кислоты
), линолевая
(ПНЖК) участвуют в расщеплении липопротеидов низкой плотности,
являясь предшественниками гормоноподобных веществ простагландинов, препятствующих отложению холестерина в стенках кровеносных
сосудов; предотвращают агрегацию кровяных телец и образование
тромбов, снимают воспалительные процессы и могут способствовать
профилактике целого ряда заболеваний. Полиненасыщенные жирные
кислоты – линолевая, линоленовая и другие – не синтезируются в
организме человека и должны поступать в организм с пищей.
В связи с тем, что эти кислоты необходимы для нормальной
жизнедеятельности организма, их относят к незаменимым жирным
кислотам. Часто комплекс 23 этих кислот объединяют в группу
витаминов F. От длины углеводородных цепей жирных кислот,
входящих в состав жира, и от содержания в нем ненасыщенных
жирных кислот зависит его точка плавления. Растительные масла
жидкие потому, что в них много ненасыщенных жирных кислот.
Лабораторная работа 6
Сравнение степени ненасыщенности жирных кислот
в различных жирах
Пользуясь способностью ненасыщенных органических соединений присоединять галоген по месту двойной связи, можно определить
наличие в жире ненасыщенных жирных кислот по количеству йода,
потребовавшегося для насыщения жира:
R - CH = CH – R1+J2 +H2O = R - JCH- ОНC H –R1 +HJ.
40
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]