Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Промышленная микробиология. Лабораторный практикум
.pdf
Лабораторная работа № 5
CH
3
N
H
O
OH
O
CH
3
CH
3
N
H
O
OH
O
CH
3
NH
2
OH
O
CH
3
D-, L-рацемат
N-ацетилаланина
аминоацилаза I
D-N-ацетилаланин
L-аланин
+
H2O
CH3COOH
O
O
O
NH
2
OH
O
CH
3
O
N
O
O
O
CH
3
H
O
+
+
H3O
+
CO
2
L-аланин
нингидрин
пурпурный анион (592 нм)
ФЕРМЕНТАТИВНОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ РАЦЕМИЧЕСКОЙ
СМЕСИ L, D-N-АЦЕТИЛАЛАНИНА
Цель: ознакомление с методами ферментативного разделения
оптических изомеров аминокислот, овладение лабораторными навыками проведения таких процессов, определение выхода целевого
продукта.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Многие ферменты обладают высокой каталитической селективностью и могут селективно катализировать реакции только с одним
из энантиомеров в рацемате. В современной химии ферменты используются во многих процессах in vitro, особенно в синтезе оптически чистых продуктов. В данном эксперименте изучается гидролиз
N-ацетилаланина в присутствии фермента аминоацилазы I (рис. 17) [6].
Рис. 17. Схема гидролиза рацемата N-ацетилаланина
под действием аминоацилазы I
За ходом реакции можно следить, если в реакционную смесь добавить нингидрин, который взаимодействует с образующимся аланином, давая яркое пурпурное окрашивание раствора [6]:
Рис. 18. Качественная реакция на аланин с нингидрином
81
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Материалы и оборудование: рацемат N-ацетилаланина; гидро-
ксид лития; фермент аминоацилаза I; 5 %-й раствор нингидрина;
литий-ацетатный буфер (для приготовления ацетатного буфера рН 5,2
необходимо взять 57,4 мл 1 М уксусной кислоты, прибавить 50,0 мл
1 М раствора NaOH и разбавить полученный раствор до 500 мл дистиллированной водой); диметилсульфоксид; УФ-спектрофотометр;
мерная пипетка; фильтровальная воронка со стеклянным фильтром;
мерные цилиндры; водяная баня.
ХОД РАБОТЫ
Растворите рацемат N-ацетилаланина (262 мг; 2,0 ммоль) в 10 мл
воды. Медленно, при осторожном перемешивании прибавляйте раствор моногидрата гидроксида лития (84 мг; 2,0 ммоль) в 4 мл воды
до тех пор, пока рН раствора не станет равным 7. Контролируйте рН
лакмусовой бумагой. При перемешивании прибавьте раствор аминоацилазы I (10 мг) в 5 мл воды (водный раствор аминоацилазы I готовится следующим образом: навеска фермента растворяется в воде,
затем раствор отфильтровывается на стеклянном фильтре). После
этого доведите объем раствора водой до 20,0 мл (точно). Поместите
реакционную смесь в водяную баню (37 °С) на 60 мин. Затем перенесите мерной пипеткой 0,25 мл реакционной смеси в пробирку и добавьте туда 1,25 мл раствора нингидрина. Эту смесь нагревайте в кипящей воде в течение 20 мин, при этом появится интенсивная пурпурная окраска. После охлаждения аккуратно добавьте содержимое
пробирки к 20 мл буферного раствора, состоящего из литийацетатного буфера (рН 5,2) и диметилсульфоксида в соотношении
1:3, который находится в мерной колбе на 250 мл. Доведите объем
раствора водой до 250 мл. Измерьте оптическую плотность на УФспектрофотометре при λ = 592 нм. В качестве стандарта используйте
раствор нингидрина в том же литий-ацетатном буфере и диметилсульфоксиде (молярный коэффициент поглощения ε пурпурного
комплекса равен 13350 л·Моль-1·см-1).
82
Отбирайте пробы через 15, 30, 45 и 60 мин после начала реакции
Cl
I
I
D
o
lg
и определите концентрацию L-аланина.
В отчет необходимо включить следующие данные:
1. Начальная концентрация рацемического N-ацетилаланина
в моль/л.
2. Значение оптической плотности при λ = 592 нм.
3. Используя закон Бугера – Ламберта – Бера, рассчитайте коли-
чество аланина (в ммоль), образовавшегося в результате ферментативной реакции, по формуле (5):
, (5)
где D – оптическая плотность раствора;
Io – интенсивность падающего на раствор света, Вт/м2;
I – интенсивность света, прошедшего через раствор, Вт/м2;
ε – молярный коэффициент поглощения вещества, л·Моль-1·см-1;
С – концентрация вещества в моль/л;
l – толщина кюветы, см.
4. Рассчитайте степень превращения рацемата N-ацетилаланина.
5. Постройте график зависимости концентрации аланина от вре-
мени и оцените оптимальное время проведения реакции.
83
ПРИЛОЖЕНИЕ
Проба
Объем
стандартного
раствора, мл
Количество
тирозина,
мкМ/мл
Объем 0,2 М
раствора HCl, мл
Объем 0,5 М
раствора гидроксида
натрия
1
0,1
0,1
4,9
5,0
2
0,2
0,2
4,8
5,0
3
0,5
0,5
4,5
5,0
4
1,0
1,0
4,0
5,0
5
1,5
1,5
3,5
5,0
6
2,0
2,0
3,0
5,0
Приготовление реактива Фолина – Чокальтеу
100 г вольфрамата натрия (Na2WO4·2Н2О), 25 г молибдата натрия
(Na2MoO4·2Н2О) и 700 мл дистиллированной воды поместить в круглодонную
колбу. Добавить 50 мл фосфорной кислоты (85 %) и 100 мл концентрированной
соляной кислоты. Присоединить обратный холодильник и осторожно кипятить
в течение 10 часов. Затем добавить 150 г сульфата лития (Li2SO4), 50 мл воды
и несколько капель жидкого брома (Br2). Убрать дефлегматор и продолжать кипятить ещё 15 мин для удаления излишков брома. Охладить, довести объём
до 1 л и профильтровать. Полученный реактив не должен иметь зеленоватой
окраски, т.к. это означает наличие в нём продуктов реакции восстановления
голубого цвета.
Построение калибровочного графика по тирозину
Стандартный раствор тирозина (1 мМ/л) готовят растворить 181,19 мг
L-тирозина (пригодна D- и DL-форма) в 50 мл 0,2 М HCl и довести до 1000 мл
дистиллированной водой. Хранить в холодильнике при 4 оС.
Растворы для построения калибровочного графика готовят в соответствии
с табл. П1.
В пробирки добавляют по 0,5 мл реактива Фолина – Чокальтеу. Смесь
тщательно перемешивают, появляется синее окрашивание. Интенсивность окраски через 10 мин измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны
690 нм (светофильтр красный). Строят график, откладывая по оси абсцисс количество тирозина в мкМ, по оси ординат – оптическую плотность.
Таблица П1
Состав растворов для построения калибровочного графика
84
СПИСОК РЕКОМЕНДОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Основы биотехнологии: лаборатор. практикум. Ч. 1 / Сост.
В.В. Бахарев, З.Е. Мащенко. – Самара: Самар. гос. техн. ун-т, 2015. – 127 с.
2. Биохимия: учебник для студентов медицинских вузов / Л.В. Авдеева
и др.; под ред. Е.С. Северина. – 5-е изд. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 759 с.
3. Катаболизм углеводов: https://poznayka.org/
4. Захарова И.Н., Суркова Е.Н. Роль полиненасыщенных жирных кислот
в формировании здоровья детей // Педиатрия. Журнал им. Г.Н. Сперанского. –
2009. – № 6. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/rol-polinenasyschennyh-zhirnyhkislot-v-formirovanii-zdorovya-detey
5. Биотехнология биологически активных веществ / Под ред. И.М. Граче-
вой, Л.А. Ивановой. – М.: НПО «Элевар», 2006. – 453 с.
6. Инженерная энзимология: учеб. пособие по курсу «Биотехнология»
для студентов фармацевтического факультета. – Нижний Новгород: Изд-во
Нижегородск. гос. мед. академии, 2005.
7. Волова Т.Г. Биотехнология. – Новосибирск: Изд-во Сибирского отде-
ления Российской Академии наук, 1999. – 252 с.
8. Основы биотехнологии: лаборатор. практикум. Ч. 2 / Сост. В.В. Бахарев,
З.Е. Мащенко. – Самара: Самар. гос. техн. ун-т, 2015. – 72 с.
9. Рогов И.А., Антипова Л.В., Шуваева Г.П. Пищевая биотехнология. –
М.: КолосС, 2004. – 440 с.
10. Неверова О.А., Гореликова Г.А., Позняковский В.М. Пищевая биотехно-
логия продуктов из сырья растительного происхождения. – СибГУ, 2007. – 415 с.
11. Прищеп Т.П. Основы фармацевтической биотехнологии: учеб. пособие. –
Ростов н/Д: Феникс; Томск: Издательство НТЛ, 2006. – 256 с.
12. Биотехнология: учебник / И.В. Тихонов, Е.А. Рубан, Т.Н. Грязнева и др.;
под ред. Е.С. Воронина. – СПб.: ГИОРД, 2008. – 704 с.
13. Сельскохозяйственная биотехнология: учебник / В.С. Шевелуха,
Е.А. Калашникова, Е.С. Воронин и др. – М.: Высш. шк., 2003. – 416 с.
14. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. – М.: КолосС,
2004. – 296 с.
15. Орехов С.Н. Фармацевтическая биотехнология: учеб. пособие / Под ред.
В.А. Быкова, А.В. Катлинского. – М.: ГЭОТАРРМедиа, 2009. – 384 с.
16. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и при-
менение. – М.: Мир, 2002. – 589 с.
85
17. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. – СПб.: Наука, 1995. – 600 с.
18. Воробьева Л.И. Промышленная микробиология: учеб. пособие. – М.: Изд-
во МГУ, 1989.
19. Хиггинс И., Бест Д., Джонс Дж. Биотехнология: принципы и примене-
ния. – М.: Мир, 1988. – 480 с.
20. Руклиш М.П., Швинка Ю.Э., Виестур У.Э. Биотехнология бактериаль-
ного синтеза. – Рига: Зинатне, 1992. – 367 с.
86
СОДЕРЖАНИЕ
Введение ....................................................................................................................... 3
Теоретический материал к коллоквиуму № 1 ......................................................... 4
Лабораторная работа № 1. Биотехнологическое получение органических
кислот. Микробиологический синтез молочной кислоты .................................... 20
Теоретический материал к коллоквиуму № 2 ....................................................... 26
Лабораторная работа № 2. Биотехнологическое получение растворителей.
Микробиологический синтез этанола ..................................................................... 36
Теоретический материал к коллоквиуму № 3 ....................................................... 39
Лабораторная работа № 3. Переработка дрожжевой биомассы.
Выделение биожира и фосфолипидов ..................................................................... 61
Теоретический материал к коллоквиуму № 4 ....................................................... 64
Лабораторная работа № 4. Изучение закономерностей ферментативного
катализа. Определение активности трипсина ........................................................ 76
Лабораторная работа № 5. Ферментативное разделение рацемической смеси
L, D-N-ацетилаланина ............................................................................................... 81
Приложение ............................................................................................................... 84
Список рекомендованной литературы .................................................................... 85
87
Учебное издание
БАХАРЕВ Владимир Валентинович
Промышленная микробиология
Редактор О.Н. Акопян
Компьютерная верстка И.О. Миняева
Выпускающий редактор Ю.А. Петропольская
Подписано в печать 11.03.22
Формат 60×84 1/16. Бумага офсетная
Усл. п.л. 5,11. Уч.-изд. л. 5,05
Тираж 50 экз. Рег. № 10/22
Федеральное государственное бюджетное
образовательное учреждение высшего образования
«Самарский государственный технический университет»
443100, г. Самара, ул. Молодогвардейская, 244. Главный корпус
Отпечатано в типографии
Самарского государственного технического университета
443100, г. Самара, ул. Молодогвардейская, 244. Корпус № 8
88
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]