Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Промышленная микробиология. Лабораторный практикум
.pdf
ется в клеточный материал: а остальной трансформируется в молочную кислоту, выход которой достигает до 1,5 %. Теоретически
из 1 моля глюкозы должно образоваться 2 моля лактата. На практике эта величина несколько ниже, 1,8 моля, то есть выход продукта
от субстрата достигает 90 %.
Промышленное производство молочной кислоты было начато
в конце ХIХ века с применением молочнокислых бактерий
Lb. delbrueckii, Lb. leichmannii, Lb. bulgaricus. Молочнокислое брожение
протекает в анаэробных условиях, однако лактобациллы относятся
к факультативным анаэробам, поэтому при ферментации воздух полностью не удаляют из ферментеров. В качестве сырья используют сахарную и тростниковую мелассу и гидролизаты крахмала, при этом концентрация сахаров в исходной среде, в зависимости от характера брожения, составляет примерно от 5 до 20 %. Используют восстановленные формы азота, сульфаты или фосфаты аммония, а также солод и кукурузный экстракт в качестве источника факторов роста. Возможно использование сульфитного щелока с участием бактерий Lb. delbrueckii.
Ферментацию проводят в глубинной культуре при рН 6,3–6,5 и строго
постоянной температуре 50 °С. Длительность процесса составляет
до 7–11 суток.
В ходе процесса брожения для коррекции изменяющегося рН
в культуру вносят мел 3–4 раза в течение суток. Конечная концентрация образующегося лактата кальция составляет 10–15 %, остаточная
концентрация углеводов – 0,5–0,7 %. На стадии получения готового
продукта культуральную среду нагревают до 80–90 °С, затем нейтрализуют гашеной известью до слабощелочной реакции. После отстаивания в течение 3–5 ч взвешенные частицы декантируют. После этого
раствор лактата кальция подают на фильтр-пресс. Фильтрат упаривают до концентрации 27–30 %, охлаждают до 25–30 °С и подвергают
кристаллизации.
21
Посевной материал
Питательная среда
Размножение чистой культуры
Солодовый
экстракт
Молочнокислое брожение
Гашеная
известь
Обработка культуральной жидкость
Фильтрация
Кристаллизация лактата кальция
Сернаяя
кислота
Разложение лактата кальция серной кислотой
Очистка раствора молочной кислоты
K4[Fe(CN)6]
Активирован ный уголь
Фильтрация
Гипсовый
шлам
Пар
Пар
Первое упаривание до концентрации раствора 50%
Фильтрация
Гипсовый
шлам
Второе упаривание до концентрации раствора 50%
Фильтрация
Гипсовый
шлам
Розлив в тару
Обработка культуральной жидкостью
Рис. 9. Технологическая блок-схема
промышленного получения молочной кислоты
22
Кристаллы лактата кальция обрабатывают серной кислотой
(CH3CHOHCOO)2Ca + H2SO
4
CaSO4 + 2 CH3CHOHCOOH
при 60–70 °С, гипс выпадает в осадок, а к надосадочной жидкости
добавляют желтую кровяную соль при 65 °С для удаления ионов железа, затем – сульфат натрия для освобождения от тяжелых металлов.
Красящие вещества удаляют с помощью активированного угля.
После этого раствор молочной кислоты подвергают вакуумупариванию до 50 или 80 %. Оставшийся не до конца очищенный
раствор молочной кислоты используют для технических целей. Более
чистую кислоту можно получить при перегонке ее метилового эфира,
при экстракции изопропиловым эфиром в противоточных насадочных колоннах.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Материалы и оборудование: плоскодонная колба на 500 мл,
магнитная мешалка, карбонат кальция, глюкоза, автолизат пивных
дрожжей, культура молочнокислых бактерий Lactobacillus
acidophillus, серная кислота, колба Бунзена, фарфоровая воронка,
фильтр бумажный, фарфоровая чашка, электрическая плитка.
Ход работы
1. Подготовка посевного материала микроорганизма-продуцента.
2. Подготовка питательной среды для брожения.
3. Проведение процесса брожения.
4. Обработка сброженной культуральной жидкости и выделение
лактата кальция.
5. Получение молочной кислоты из лактата кальция.
Подготовка посевного материала
В качестве микроорганизма-продуцента молочной кислоты
в настоящей лабораторной работе используются следующие виды молочнокислых микроорганизмов, обладающие высокой кислотообразующей способностью: Lb. bulgaricus, Lb. acidophilus, Lb. casei, Str.
lactis.
23
Для подготовки посевного материала стерилизованное обезжиренное молоко в колбе засевают чистой культурой микроорганизмапродуцента. Культуру выдерживают в течение 24 ч при температуре
40–43 °С (для Lb. bulgarius), 37–38 °С (для Lb. acidophilus) и 25–30 °С
(для Str. lactis).
Подготовка питательной среды
В качестве питательной среды для получения молочной кислоты
микробиологическим синтезом могут быть использованы глюкоза,
лактоза или любые виды молочной сыворотки (подсырная, творожная, казеиновая), а также ультрафильтраты молочного сырья. Кислую
сыворотку предварительно нейтрализуют. Молочную сыворотку пастеризуют при температуре 70–75 °С в течение 1 часа и охлаждают
до температуры заквашивания 30 °С.
Проведение процесса брожения
В коническую колбу на 500 мл вносят 250 мл питательной среды
следующего начального состава: автолизат пивных дрожжей – 4 %
(по CB), глюкоза – 5 %, остальное – вода. Питательную среду засевают культурой молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophillus
в посевной дозе 3 об. %. Культивирование проводят при 48 °C
при постоянном перемешивании. Поддержание pH на уровне 6,4–6,6
осуществляют путем нейтрализации молочной кислоты внесением
карбоната кальция (CaCO3). Для определения кислотности бродящего
сусла отбирают пробу 10 мл в мерную колбу на 100 мл, добавляют
20 мл дистиллированной воды, две капли раствора фенолфталеина
и титруют 0,1 М раствором гидроксида натрия. Кислотность в градусах Тернера (°Т) определяют по формуле
К = 10·V, (1)
где 10 – коэффициент разбавления;
V – объем раствора гидроксида натрия, использованный для титрования, мл.
24
При достижении кислотности 65–70 °Т проводят нейтрализацию
100
18/10009,0
c
VK
сусла до кислотности 10–12 °Т путем внесения карбоната кальция.
Количество вносимого карбоната кальция определяют исходя из расчета, что для нейтрализации каждых 18 частей молочной кислоты необходимо 10 частей химически чистого карбоната кальция (1 °Т эквивалентен 0,009 % молочной кислоты). Расчет количества карбоната
кальция при кислотности сусла 70 °Т проводится согласно формуле
Масса CaCO3 (г) =
, (2)
где К – кислотность сусла в °Т;
0,009 – эквивалент молочной кислоты 1 °Т;
Vc – общий объем сусла, мл;
10/18 – соотношение массовых частей карбоната кальция и молочной кислоты при нейтрализации;
100 – молекулярная масса карбоната кальция.
Процесс молочнокислого брожения заканчивается через 48 часов.
Обработка сброженного сусла
и выделение лактата кальция
Сусло нейтрализуют карбонатом кальция до слабощелочной среды и фильтруют через складчатый фильтр. Полученный раствор упаривают в фарфоровой чашке на электрической плитке до объема
50–70 мл и охлаждают до 0–5 °С в холодильнике. Выпавший осадок
лактата кальция отфильтровывают и сушат на воздухе.
Определяют практический выход лактата кальция в граммах
и процентах от теоретического выхода. Теоретический выход молочной кислоты рассчитывают по уравнению, считая, что из 1 моля глюкозы образуется 2 моля молочной кислоты:
С6Н12О6 → 2 СН3СНОНСООН + 2 CO
25
2
ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ
К КОЛЛОКВИУМУ № 2
Брожение со времен Пастера называют «жизнью без воздуха».
Этот тип метаболизма возник на нашей планете одним из самых первых – еще в то время, когда в атмосфере отсутствовал молекулярный
кислород. Наиболее древние обитатели Земли использовали этот самый примитивный и наименее выгодный с энергетической точки зрения способ метаболизма для своей жизнедеятельности. В ходе эволюции возникли новые, более перспективные процессы запасания
энергии, однако брожение по-прежнему используется многими организмами, поскольку позволяет им осуществлять жизнедеятельность
в условиях отсутствия молекулярного кислорода.
Брожение происходит в клетках бактерий, дрожжей (для этих
микроорганизмов брожение является преобладающим типом метаболизма), простейших, моллюсков, в некоторых тканях рыб и птиц,
а также высших животных, включая человека (мышцы, хрусталик
и роговица глаза).
Известно большое разнообразие процессов брожения, которые
отличаются друг от друга субстратами, продуктами, а также химическими превращениями. При этом можно различить несколько типов
брожения, встречающихся наиболее часто: спиртовое, молочнокислое, пропионовокислое, муравьинокислое, маслянокислое, ацетонобутиловое. Свое название эти типы брожения получили от доминирующих или характерных продуктов, которые образуются в результате определенной последовательности реакций. Нетрудно заметить,
что среди продуктов преобладают органические кислоты и спирты.
Субстратами для разных типов брожения также служат органические
вещества – в большинстве случаев пируват, а также лактат, ацетилСоА, некоторые промежуточные метаболиты гликолитического пути,
аминокислоты. Таким образом, брожение можно определить как катаболический процесс, происходящий в условиях, не требующих участия молекулярного кислорода, в котором и донорами и акцепторами
электронов являются органические вещества.
26
Реакциям брожения всегда предшествуют предварительные этапы катаболизма субстратов: чаще гликолиз, реже – пентозофосфатные и фосфоглюконатный пути. Поэтому часто реакции собственно
брожения рассматривают в совокупности с предшествующими этапами, и в этом случае можно говорить о запасании энергии в ходе таких процессов. Однако следует помнить, что энергия в форме макроэргических связей АТФ запасается в процессе субстратного фосфорилирования, как правило, еще до образования пирувата. В процессах
собственно брожения энергия запасается редко, и можно назвать всего
три реакции, в которых фосфорилируется AДФ: образование масляной,
уксусной, а также ацетоуксусной кислот. В брожениях других типов
дополнительного количества энергии не образуется, и их основной задачей является регенерация окисленной формы переносчика восстановительных эквивалентов – НАД+. Это необходимо для бесперебойного
осуществления реакций гликолиза и других катаболических путей,
в ходе которых, как известно, происходит расщепление субстратов, сопровождающееся их окислением, что требует постоянного присутствия
в клетке акцепторов восстановительных эквивалентов НАД+.
Реакции анаэробного гликолиза
1. Фосфорилирование молекулы D-глюкозы
Первой реакцией гликолиза является фосфорилирование молекулы глюкозы, происходящее при участии тканеспецифичного фермента гексокиназы с затратой энергии 1 молекулы АТФ; образуется
активная форма глюкозы – глюкозо-6-фосфат (Г-6-Ф):
27
Фосфорилирование глюкозы преследует две цели: во-первых,
из-за того, что плазматическая мембрана, проницаемая для нейтральной молекулы глюкозы, не пропускает отрицательно заряженные молекулы Г-6-Ф, фосфорилированная глюкоза оказывается запертой
внутри клетки. Во-вторых, при фосфорилировании глюкоза переводится в активную форму, способную участвовать в биохимических
реакциях и включаться в метаболические циклы [3].
2. Изомерация глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат
Во второй реакции ферментом фосфоглюкоизомеразой Г-6-Ф
превращается во фруктозо-6-фосфат (Ф-6-Ф):
Энергия для этой реакции не требуется, и реакция является полностью обратимой. На данном этапе в процесс гликолиза может также включаться путём фосфорилирования и сама фруктоза [3].
3. Фосфолирование фруктозо-6-фосфата с образованием
фруктозо-1,6-дифосфата
Фосфорилирование Ф-6-Ф осуществляется фосфофруктокиназой
с затратой энергии ещё одной молекулы АТФ; это вторая ключевая
реакция гликолиза, её регуляция определяет интенсивность гликолиза
в целом. Данная реакция относится к необратимым [3].
28
4. Расщепление фруктозо-1,6-дифосфата на глицеральдегид-3-
фосфат и диоксиацетонфосфат
Альдольное расщепление Ф-1,6-дФ происходит под действием
альдолазы фруктозо-1,6-дифосфата:
Реакция обратима. Равновесие сильно сдвинуто в сторону диоксиацетонфосфата: 95 % диоксиацетонфосфата и 5 % – глицеральдегид-3-фосфата. Образованием глицеральдегид-3-фосфата как бы завершается первая стадия гликолиза. Вторая стадия наиболее сложная
и важная, она включает окислительно-восстановительную реакцию
(реакция гликолитической оксиредукции), сопряжённую с субстратным фосфорилированием, в процессе которого образуется АТФ [3].
5. Взаимопревращение триозофосфатов
В результате четвертой реакции образуются дигидроксиацетонфосфат и глицеральдегид-3-фосфат, причём первый почти сразу под
действием фосфотриозоизомеразы переходит во второй, который
и участвует в дальнейших превращениях [3]:
29
6. Окисление глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-дифосфо-
глицерата
Каждая молекула глицеральдегидфосфата окисляется НАД+
в присутствии дегидрогеназы глицеральдегидфосфата до 1,3-дифос-
фоглицерата [3]:
7. Перенос фосфатной группы с 1,3-дифосфоглицерата на АДФ
С образовавшегося 1,3-дифосфоглицерата, содержащего макроэргическую связь в 1 положении, ферментом фосфоглицераткиназой
на молекулу АДФ переносится остаток фосфорной кислоты – образуется молекула АТФ:
Это первая реакция субстратного фосфорилирования. С этого
момента процесс расщепления глюкозы перестаёт быть убыточным
в энергетическом плане, так как энергетические затраты первого этапа оказываются компенсированными: синтезируются 2 молекулы
АТФ (по одной на каждый 1,3-дифосфоглицерат) вместо двух потраченных в реакциях 1 и 3. Для протекания данной реакции требуется
30
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]