Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Промышленная микробиология. Лабораторный практикум
.pdf
Лабораторная работа № 3
ПЕРЕРАБОТКА ДРОЖЖЕВОЙ БИОМАССЫ.
ВЫДЕЛЕНИЕ БИОЖИРА И ФОСФОЛИПИДОВ
Цель: познакомиться с процессами переработки дрожжевой био-
массы, лабораторным методом получения биожира и выделения фосфолипидов.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Материалы и оборудование: хлебопекарные дрожжи, предвари-
тельно высушенные (сушка осуществляется в термостате при 100–
105 °С в течение 2 часов); коническая колба объемом 250 мл; экстракционная смесь (петролейный эфир (40–70 °С) : этанол : вода =
75:20:5); ватный тампон, качалка с термостатированием; складчатый
фильтр; круглодонная колба на 250 мл; роторный испаритель с вакуумным насосом; химический стакан на 50 мл; центрифуга; пробирка
для центрифугирования; весы с точностью 0,01 г; чашка Петри.
Ход работы
В сухую коническую (качалочную) колбу помещают 20 г предварительно высушенных (сушка осуществляется в термостате при 100–
105 °С в течение 2 часов) хлебопекарных дрожжей, взвешенных
с точностью до 0,01 г. Затем добавляют 100 мл предварительно подготовленной экстракционной смеси, состоящей из 75 % петролейного
эфира, 20 % этанола, 5 % дистиллированной воды. Колбу закрывают
ватным тампоном, ставят на качалку и проводят экстракцию липидов
в течение 1 часа при 35–40 °С.
По окончании процесса экстракции колбу снимают с качалки, содержимое колбы фильтруют через складчатый фильтр в предварительно взвешенную чистую круглодонную колбу вместимостью
250 мл. Остатки биомассы из качалочной колбы смывают на фильтр
30 мл свежей экстракционной смеси.
61
Выделение липидов из раствора (мисцеллы) проводят с помощью
отгонки растворителя на роторном испарителе под вакуумом, создаваемым вакуумным насосом.
После отгонки растворителей круглодонную колбу с биожиром
отсоединяют от прибора и помещают в сушильный шкаф, предварительно нагретый до 105 °С, выдерживают при этой температуре
30 мин для полного удаления растворителей. Затем колбу охлаждают,
взвешивают на весах с точностью до 0,01 г и определяют количество
проэкстрагированных липидов.
Количество проэкстрагированных липидов (W1, % масс.) от массы хлебопекарных дрожжей (М) определяется по формуле (3):
W1 = (m1 – m0)∙100/М(1 – W/100), (3)
где m1 – масса колбы с липидами, г;
m0 – масса пустой колбы, г;
W – содержание влаги в исследуемом образце дрожжей, % масс.
К липидам в колбе добавляют пятикратный объем ацетона и все
содержимое колбы переносят в химический стакан. Смесь перемешивают стеклянной палочкой, выпавшие в осадок фосфолипиды отделяют центрифугированием. Для этого содержимое стакана переносят
полностью в предварительно взвешенную пробирку для центрифугирования. Центрифугирование проводят при 3000 об/мин в течение
5 мин. Отделившуюся ацетоновую мисцеллу сливают декантацией
с отделившегося осадка. Пробирку с осадком помещают в сушильный
шкаф, предварительно нагретый до 105 °С, выдерживают при этой
температуре 30 мин для полного удаления растворителей. Затем пробирку охлаждают, взвешивают на весах с точностью до 0,01 г и определяют количество отделившихся фосфолипидов.
Содержание фосфолипидов в проэкстрагированном биожире
(W2, % масс.) от массы биожира (Мб) определяется по формуле (4):
W1 = (m2 – m3)∙100/Мб, (4)
где m2 – масса центрифужной пробирки с фосфолипидами, г;
62
m3 – масса пустой центрифужной пробирки, г;
М
= m1 – mo – масса полученного биожира, г.
б
Оставшийся после экстракции и фильтрования биошрот вместе
с фильтром помещают в чашку Петри, сушат в сушильном шкафу
при 105 °С в течение 1 часа, затем охлаждают, взвешивают биошрот
с точностью до 0,01 г и составляют материальный баланс процесса
экстракции.
63
ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ
К КОЛЛОКВИУМУ № 4
Ферменты – это специфические катализаторы белковой природы,
вырабатываемые клетками и тканями организмов. Они способны
во много раз ускорять течение химических и биохимических реакций,
не входя в состав конечных продуктов. Практические применения
ферментов основаны на их высокой каталитической активности и более высокой по сравнению с небиологическими каталитическими
системами субстратной специфичностью.
Источником ферментов служат растительные и животные ткани,
микроорганизмы. Химический синтез ферментов в промышленных
масштабах очень сложен, дорог и экономически не целесообразен.
Микробиологический метод получения ферментов наиболее перспективен. Его преимущества заключаются в следующем:
1) богатство ассортимента ферментов, синтезируемых микроор-
ганизмами;
2) возможность управления ферментативными системами и со-
ставом производимых препаратов;
3) высокие скорости размножения микроорганизмов и возмож-
ность использования различных, в том числе доступных и недорогих
субстратов. Ферменты в микробных клетках могут иметь внутриклеточную локализацию, такие ферменты называются эндогенными.
Ферменты, которые клетки выделяют в окружающую среду, называются экзогенными. Последние более доступны для препаративного
получения, поэтому в промышленных масштабах получают, главным
образом, внеклеточные ферменты. Из описанных к настоящему времени более 2000 ферментов практическое значение имеют около 50.
Согласно современной классификации, все ферменты подразделяются на 6 классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы,
изомеразы и лигазы (синтетазы).
Широкие перспективы открылись перед инженерной энзимологией в результате создания нового типа биоорганических катализато-
64
ров, так называемых иммобилизованных ферментов. Термин «иммобилизованные ферменты» узаконен сравнительно недавно, в 1974 г.
Сандэремом и Реем, хотя еще в 1916 г. Нельсон и Гриффит показали,
что инвертаза, адсорбированная на угле или алюмогеле, сохраняет
свою каталитическую активность. Однако начало целенаправленных
исследований, ориентированных на создание такого рода стабилизированных ферментных катализаторов, относится к середине XX века.
Иммобилизация – это процесс прикрепления ферментов к поверхности природных или синтетических материалов, включение их в полимерные материалы, полые волокна и мембранные капсулы, поперечная химическая сшивка. Иммобилизацию также можно характеризовать как физическое разделение катализатора и растворителя, в ходе
которого молекулы субстрата и продукта легко обмениваются между
фазами. Разделение может быть достигнуто адсорбционным или ковалентным связыванием фермента с нерастворимыми носителями либо связыванием отдельных молекул фермента с образованием агрегатов. При иммобилизации ферментов происходит стабилизация каталитической активности, так как этот процесс препятствует денатурации белков. Иммобилизованный фермент, имеющий ограниченную
возможность для конформационных перестроек, быстрее растворимого находит кратчайший путь к функционально активной конформации. Иммобилизованные ферменты приобретают помимо стабильности отдельные свойства, не характерные для их свободного состояния, например, возможность функционировать в неводной среде, более широкие зоны оптимума по температуре и рН.
Сферы применения иммобилизованных ферментов разнообразны
– это тонкий органический синтез и преобразование энергии, физикохимические, аналитические методы исследования и получение целевых продуктов, конверсия растительного сырья и создание лекарственных препаратов.
Высокие скорости протекания реакций в «мягких» условиях,
уникальная специфичность и стереоспецифичность действия ферментов позволяют создавать на их основе эффективные и перспективные
65
технологические процессы. В настоящее время успехи в тонком органическом синтезе на основе иммобилизованных ферментов особенно
наглядны в сфере получения лекарственных препаратов (антибиотиков, стероидов, простагландинов). С использованием иммобилизованных ферментов созданы процессы получения более эффективных
аналогов существующих антибиотиков пенициллинового ряда и цефалоспоринов, модификация которых химическим путем является
чрезвычайно сложной задачей. Так, на основе иммобилизованной пенициллинацилазы реализован процесс эффективного деацилирования
бензилпенициллина, являющегося сырьем для получения 6-аминопеницилановой кислоты (6-АПК). Это достаточно простой технологический процесс, протекающий в одну стадию при обычных условиях в диапазоне температур 10–40 °С. Промышленная реализация процесса получения 6-АПК привела к существенному увеличению выпуска полусинтетических пенициллинов и удешевлению их. На основе этого же фермента разработан процесс получения 7-аминодезацетоксицефалоспоровой кислоты, представляющей собой ключевой субстрат для синтеза новых цефалоспоринов.
В качестве примера можно привести одновременную иммобилизацию микроорганизма Penicillium chrysogenium продуцента бензилпенициллина и выделенного из Escherichia coli фермента пенициллинацилазы. В результате из синтезированного пенициллина образуется
продукт его ферментативного гидролиза 6-аминопенициллановая кислота (ключевое соединение для синтеза новых пенициллинов). Система может быть вновь усложнена включением в нее еще одного иммобилизованного фермента, катализирующего присоединение
к 6-аминопенициллановой кислоте нового радикала взамен отщепленного. В итоге при использовании такой совокупности промышленных биокатализаторов можно получать практически совершенно
новые полусинтетические пенициллины (рис. 12).
Примером успешного применения методов инженерной энзимологии служит получение одной из важнейших групп лекарств микробного происхождения – беталактамных антибиотиков.
66
S
N
CH
3
CH
3
O
N
H
O
O
OH
H
S
N
CH
3
CH
3
O
NH
2
O
OH
S
N
CH
3
CH
3
O
N
H
O
O
OH
H
OH
NH
2
S
N
CH
3
CH
3
O
N
H
O
O
OH
H
NH
2
S
N
CH
3
CH
3
O
N
H
O
O
OH
H
NH
O
N
NH
O
Бензилпенициллин
продуцент:
Penicillium chrysogenum
Иммобилизованная
пенициллацилаза из
Escherichia coli
6-Аминопенициллановая
кислота
(6-АПК)
Амоксициллин
Иммобилизованная синтетаза
из Xanthomonas sp.
Ампициллин
Азлоциллин
Рис. 12. Использование «системы, открытой для усложнения»
Процесс получения полусинтетических цефалоспоринов включает как «классический» биосинтез исходного цефалоспорина С и органический синтез на стадии получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-АЦК), так и две ключевые стадии, в которых участвуют иммобилизованные ферменты – гидролаза из Pseudomonas sp. и синтетазы из Xanthomonas sp. и Е. соli. На рис. 13 показано последовательное
применение ряда иммобилизованных ферментов при получении из
для получения полусинтетических пенициллинов
67
цефалоспорина С (малоценного в практическом отношении природ-
S
N
O
O
O
CH
3
O OH
N
H
O
OH
NH
2
O
S
N
O
O
O
CH
3
O OH
N
OH
NH
2
O
Cl
S
N
O
O
O
CH
3
O OH
NH
2
S
N
O
O
O
CH
3
O OH
N
H
O
OH
O
PCl
5
S
N
O
O OH
N
H
R1
R
O
S
N
O
O OH
N
H
R1
R
O
Иммобилизованная
оксидаза
D-аминокислот
Имидоилхлорид
Глутарил-7-аминоцефалоспорановая кислота
(Глутарил-7-АЦК)
H2O
Иммобилизованная
гидролаза из
Pseudomonas sp.
Иммобилизованная
синтаза из
Xanthomonas sp.
Цефалоспорин С
продуцент:
Chephalosporum acremonium
(Acremonium chrysogenum)
Иммобилизованная
синтаза из
Escherichia coli
Цефоперазон
Цефалоглицин
Цефалотин
Цефалоридин
Цефазолин
ного цефалоспорина) полусинтетических оральных и инъекционных
цефалоспоринов с разными спектрами действия, обладающих высокой эффективностью в клинике.
Рис. 13. Получение полусинтетических цефалоспоринов
с помощью иммобилизованных ферментов
68
Заместители в полусинтетических цефалоспоринах
Название
R
R1
Цефалотин
S
-O-COCH3
Цефалоридин
S
N
+
Цефазолин
N
N
N
N
S
N
N
S
CH
3
Цефоперазон
NN
Et
O O
O
N
H
OH
S
N
N
N
N
CH
3
Цефалоглицин
NH
2
-O-COCH3
Таблица 2
В нижней части рис. 13 показаны различия в субстратной специфичности синтетаз из Е. соli и Xanthomonas sp. Первую целесообразно
использовать для синтеза цефалотина, цефалоридина и цефазолина, а
вторую – для получения цефалоглицина и цефоперазона (табл. 2).
Перспективно применение ферментативного катализа для получения лекарственных веществ ряда эйкозаноидов (простагландинов,
тромбоксанов, простациклинов, лейкотриенов) из арахидоновой кислоты с использованием сложных полиферментных систем. Ключевым ферментом здесь является простагландин-Н-синтетаза, катализирующая реакцию окисления арахидоновой кислоты кислородом и донором электронов в виде NADH, триптофана, ферроцианида. Следует
отметить, что исходный субстрат для этих реакций, арахидоновая кислота, может быть получена из растительных масел с использованием
специфических фосфолипаз [4].
69
H O
O
O
P
O
O
O
O
O
N
+
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
OH
O
CH
3
O
OH
CH
3
H OH
H
H
O
O
CH
3
H OH
H
OH
O
O
OH
O
OH
CH
3
H OH
H
H
O
OH
OH
O
OH
OH
S-Cys-Gly
CH
3
Фосфолипиды плазматической мембраны
Лизофосфолипиды
фосфолипаза А2
Арахидоновая кислота
(цис-5,8,11,14-эйкозатетраеновая кислота)
простагландин-Н-синтаза
(диоксигеназа + пероксидаза)
Прстагландин PH
2
Прстациклин I
2
Тромбоксан В
2
арахидонат-липоксигеназы
Лейкотриен D
4
Рис. 14. Схема биосинтеза отдельных представителей эйкозаноидов
из арахидоновой кислоты
Эйкозаноиды образуются почти во всех клетках организма.
Биосинтез начинается с гидролиза фосфолипидов плазматической
мембраны под действием фосфолипазы A2. Активность этого фер-
70
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]