Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Промышленная микробиология. Лабораторный практикум
.pdf
мента строго контролируется гормонами. Свободная арахидоновая
кислота также является биологически активным соединением. Однако гораздо большее значение имеют её метаболиты: простагландины, простациклины, тромбоксаны и лейкотриены, которые носят
групповое название эйкозаноиды. К эйкозаноидам ведут два главных пути биосинтеза. Первый инициируется простагландин-Нсинтазой, обладающей свойствами циклооксигеназы и пероксидазы,
второй – липоксигеназой [4].
Простагландин-Н-синтаза катализирует двухстадийную реакцию
превращения арахидоновой кислоты в простагландин РH2. Последующие реакции, катализируемые различными ферментами, приводят
к образованию простагландинов, простациклинов и тромбоксанов.
Окисление полиеновых кислот при участии липоксигеназы
приводит к образованию гидроперокси- и гидроксипроизводных
жирных кислот, из которых путём дегидратации и за счёт различных реакций переноса образуются лейкотриены. На схеме (рис. 14)
приведены структурные формулы отдельных представителей разных групп эйкозаноидов.
Эйкозаноиды обладают чрезвычайно разносторонней физиологической активностью. Они служат вторичными мессенджерами гидрофильных гормонов, контролируют сокращение гладкомышечной ткани (кровеносных сосудов, бронхов, матки), принимают участие в высвобождении продуктов внутриклеточного синтеза (гормонов, соляной кислоты, мукоидов), оказывают влияние на метаболизм костной
ткани, периферическую нервную систему, иммунную систему, передвижение и агрегацию клеток (лейкоцитов и тромбоцитов), являются
эффективными лигандами болевых рецепторов. Эйкозаноиды действуют как локальные биорегуляторы путём связывания с мембранными рецепторами в непосредственной близости от места их синтеза как
на синтезирующие их клетки (аутокринное действие), так и на соседние клетки (паракринное действие). В некоторых случаях их действие
опосредовано цАМФ и цГМФ [4].
71
В настоящее время основной промышленный способ получения
O
OH
O
ONH
4
OH
O
OH
O
NH
2
CH
3
OH
O
NH
2
Фумарат аммония
Аспарагиновая кислота
Аланин
аспартатдекарбоксилаза
аспартатаммиаклиаза
(аспартаза)
L-аланина – ферментативное декарбоксилирование L-аспарагиновой
кислоты.
Процесс превращения L-аспартата в L-аланин катализируется аспартат-β-декарбоксилазой ряда микроорганизмов (Pseudomonas
dacunhae, Alcaligenes faecalis, Achromobacter pestifier), иммобилизованных в полиакриламидном геле, каррагинане или полиуретане. Установка, разработанная японской фирмой «Танабе Сейяку», производит этим способом 10 тонн L-аланина в месяц. Усовершенствование
процесса связано с использованием в качестве сырья фумарата аммония. В данном случае процесс получения L-аланина становится двустадийным и реализуется в двух последовательно расположенных реакционных колонках. На первом этапе фумарат аммония превращается в L-аспарагиновую кислоту, которая без выделения из реакционной среды на втором этапе претерпевает β-декарбоксилирование с
образованием аланина (рис. 15) [6]:
Рис. 15. Получение аланина из фумарата аммония
В производстве аминокислот широко применяют иммобилизованные аминоацилазы в качестве реагентов для трансформации биологически активных веществ (например, N-ациламинокислот). Известно, что аминокислоты, получаемые химическим синтезом, представляют смесь L и D-изомеров (рацемат), а организм человека способен утилизировать только L-изомеры; D-изомеры накапливаются
в организме и могут оказывать вредное воздействие. Для разделения
72
L и D-изомеров в аминокислотном рацемате существуют разные хи-
CH
3
N
H
O
OH
O
R
CH
3
N
H
O
OH
O
R
NH
2
OH
O
R
CH
3
OH
O
D-, L-рацемат
N-ацетиламинокислоты
H2O
аминоацилаза
D-N-ацетиламинокислота
L-аминокислота
+
нагревание
мические способы, но наиболее простым является ферментативное
разделение с помощью аминоацилазы. Этот фермент, обладая уникальной способностью гидролизовать ацильные производные всех
природных аминокислот (за исключением пролина), проявляет свойство L-стереоспецифичности, т. е. гидролизует связь СО-NH только
в ацильных производных L-изомеров [1]. Схема разделения L
и D-изомеров аминокислот представлена на рис. 16:
Используя разные растворимости, разделяют L-аминокислоту
и N-ацетил-D-аминокислоту, при этом одна остается в растворе одна,
а другая выпадает в осадок [5].
Получение L-аминокислот ферментативным разделением химических рацемических смесей D, L-аминокислот реализовано на промышленном уровне фирмой «Танабе Сейяку». В качестве исходного
сырья используют полученные химическим синтезом ацилированные
D, L-аминокислоты (метионин, валин, фенилаланин, триптофан), раствор которых пропускают через колонку объемом 1 м3, заполненную
иммобилизованной аминоацилазой. Фермент гидролизует L-ацилизомеры аминокислот, после отщепления объемной ацильной группы
более мелкие и растворимые молекулы L-аминокислот выводятся
из биореактора через мембрану. В конце концов в реакционной смеси
остаются только непрореагировавшие ацил-D-аминокислоты.
Рис. 16. Разделение L и D-изомеров аминокислот
с помощью аминоацилазы
73
Они нагреваются и вновь превращаются в D, L-рацемат, который возвращается на разделение. Период полуинактивации фермента, иммобилизованного на полимерной смоле, составляет 65 дней. Периодически в колонку доливают свежую порцию раствора фермента, который
вновь адсорбируется смолой. Время работы колонки без смены носителя составляет более 8 лет [6].
Интересные возможности были обнаружены при использовании
ферментов для повышения чувствительности иммунохимических методов анализа. Суть любого иммунохимического анализа в том, что после
завершения реакции антиген-антитело определить концентрацию избыточного компонента (антигена или антитела), не вступившего в реакцию. Поскольку эти концентрации очень невысоки (10
-12
–10-8 моль/л),
то для их обнаружения обычно применяют легко детектируемую метку
радиоактивным атомом, вводимым в один из компонентов (радиоактивный йод, тритий). Оказалось, что можно заменить использование
радиоактивной метки на взаимодействие с ферментом, который можно
обнаружить по его каталитической активности без потери чувствительности метода. Таким образом, с помощью иммуноферментного анализа
(ИФА) могут быть определены любые вещества, обладающие свойствами антигенов и, конечно, многочисленные возбудители заболеваний
человека, животных, растений.
Получение глюкозо-фруктозных сиропов – важный с точки зре-
ния диетологии процесс впервые был реализован в промышленности
в 1973 г. американской компанией «Клинтон Корн». В настоящее
время это самый крупнотоннажный промышленный процесс на основе иммобилизованных ферментов [6].
Фруктоза, по сравнению с глюкозой, обладая более приятным
вкусом, на 60–70 % слаще, то есть ее потребляется меньше, чем
обычного сахара, кроме того, метаболизм фруктозы в организме человека не связан с превращением инсулина, она менее вредна для зубов. Технологии получения глюкозо-фруктозных сиропов за короткий срок были разработаны и освоены в промышленных масштабах
многими западными странами. В 1980 г. их выпуск составил 3,7 млн
тонн. Продукт с товарным названием «изоглюкоза» поступает на ры-
74
нок в виде сиропов, содержащих глюкозу и фруктозу в соотношении,
близком к 1:1; с использованием разделительных процессов типа
жидкостной хроматографии содержание фруктозы может быть повышено до 90 %.
Биохимическая сущность процесса сводится к превращению
(изомеризации) глюкозы, предварительно полученной в результате
гидролиза кукурузного или картофельного крахмала, во фруктозу под
воздействием иммобилизованной глюкозоизомеразы. Реакция протекает в одну стадию до тех пор, пока в реакционной смеси соотношение глюкозы и фруктозы практически не уравняется. Конечным продуктом может быть данный раствор; фруктоза может быть отделена
из раствора, а глюкоза – подвергнута дальнейшей изомеризации [6].
Получение сахаров из молочной сыворотки в процессе ферментативного гидролиза позволяет получать дополнительные количества
сахаристых веществ из отходов молочной промышленности. Первые
промышленные процессы гидролиза лактозы молочной сыворотки
с использованием иммобилизованной лактазы осуществлены в 1980 г.
в Англии и Франции. Предварительно деминерализованную сыворотку пастеризуют и затем пропускают через ферментационную колонку
с иммобилизованной лактазой. Период полуинактивации фермента
удается увеличить до 60 суток, мощность установок – 1000 л/ч
при 80 % конверсии лактозы. Получаемые при этом глюкоза и галактоза превосходят по степени сладости обычные сахара в 1,5 раза
при равных экономических показателях [7].
Вопросы к коллоквиуму
1. Дайте определение понятию «ферменты». Какова структура ферментов?
2. На основе какого признака классифицируют ферменты?
3. Что такое иммобилизованные ферменты? Охарактеризуйте методы
иммобилизации ферментов.
4. В чем преимущества использования иммобилизованных ферментов?
5. Приведите примеры промышленной реализации процессов с участием
иммобилизованных ферментов.
6. Опишите промышленные процессы получения глюкозо-фруктозных си-
ропов, антибиотиков пенициллинового и цефалоспоринового ряда, биосинтез
эйкозаноидов и метода разделения D, L-изомеров аминокислот.
75
Лабораторная работа № 4
Проба
Раствор
казеина, мл
Фосфатный
буфер, мл
Раствор
ТХУ, мл
Раствор
трипсина, мл
Опытная
1
1,5
–
0,5
Контрольная
1
1,5
3
0,5
ИЗУЧЕНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ФЕРМЕНТАТИВНОГО
КАТАЛИЗА. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ТРИПСИНА
Цель: определение показателей каталитической активности фер-
мента трипсина и факторов, влияющих на ферментативную активность.
ХОД РАБОТЫ
Опыт 1. Определение протеолитической
активности трипсина
Материалы и оборудование: кристаллический трипсин,
-4
5·10
%-й раствор в 0,005 моль/л растворе НСl, казеин 1 %-й раствор;
0,1 %-й раствор фосфатного буфера (рН 8,0); трихлоруксусная кисло-
та (ТХУ), 5 %-й раствор; реактив Фолина – Чокальтеу (приготовление
см. прил.); NaOH, 0,5 моль/л раствор; пипетки объемом 1 и 2 мл; пробирки; фильтры; конические воронки; бюретки для растворов ТХУ
и NaOH; термостат (37 оС); фотоэлектроколориметр (ФЭК); кюветы
с толщиной слоя 1,0 см.
Определение протеолитической активности трипсина основано
на количественном определении тирозина в продуктах расщепления
казеина. В качестве реагента на тирозин используется реактив Фолина – Чокальтеу, дающий с тирозином синее окрашивание, интенсивность которого определяется фотоколориметрически.
Постановка ферментативной реакции. В двух пробирках гото-
вят инкубационные смеси, как указано в табл. 3.
Таблица 3
Состав инкубационных смесей
при 37 оС в течение 20 мин. После окончания инкубации в опытную
Пробы тщательно перемешивают и инкубируют в термостате
76
пробу для прекращения реакции добавляют 3 мл 10 %-го раствора
ТХУ, перемешивают. Через 5–10 мин обе пробы фильтруют через
бумажный фильтр.
Определение концентрации тирозина. В две пробирки наливают
по 5 мл 0,5 моль/л раствора гидроксида натрия, затем в одну из них
наливают 2,5 мл полученного фильтрата контрольной пробы, в другую – 2,5 мл фильтрата опытной пробы, в обе пробирки добавляют
0,5 мл реактива Фолина – Чокальтеу. Смесь тщательно перемешивают, появляется синее окрашивание. Интенсивность окраски через
10 мин измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны
690 нм (светофильтр красный). Находят разность между оптической
плотностью опытной и контрольной проб. Затем по калибровочному
графику (построение калибровочного графика см. прил.) определяют
прирост тирозина (мкмоль/мл) в растворе в результате ферментативного гидролиза казеина.
Расчёт активности трипсина. Рассчитывают активность трипсина
в единицах на 1 мл раствора фермента, а затем на 1 мг белка (удельная
активность). При расчёте удельной активности необходимо помнить,
что использовался раствор трипсина с концентрацией 5·10
-4
%.
Опыт 2. Наблюдение за действием трипсина во времени
Материалы и оборудование: казеин, 1 %-й раствор; 0,1 %-й
раствор фосфатного буфера (рН 8,0); ТХУ, 5 %-й раствор; трипсин
5·10-4 %-й раствор в 0,005 моль/л НСl; гидроксид натрия, 0,5 моль/л
раствор; реактив Фолина – Чокальтеу; пипетки; пробирки; термостат;
конические воронки; фильтры; фотоэлектроколориметр; кюветы
с толщиной слоя 1,0 см.
В пять пробирок наливают по 1 мл раствора казеина, по 1,5 мл
фосфатного буфера, затем добавляют в четыре пробирки по 0,5 мл
раствора трипсина, а в пятую пробирку (контрольную) перед добавлением трипсина вносят 3 мл ТХУ. Затем пробы инкубируют в термостате при 37 оС.
77
Через каждые 10 мин инкубации извлекают одну пробирку, до-
№ пробы
Раствор
казеина, мл
Фосфатный
буфер, мл
Раствор
трипсина, мл
1
1,0
1,9
0,1
2
1,0
1,7
0,3
3
1,0
1,5
0,5
4
1,0
1,2
0,8
бавляют 3 мл раствора ТХУ, тщательно перемешивают и фильтруют.
Определяют концентрацию тирозина. Для этого отбирают
по 2,5 мл фильтрата из каждой пробы в отдельную пробирку. Добавляют к фильтратам по 0,5 мл реактива Фолина – Чокальтеу и тщательно перемешивают. Через 10 мин измеряют интенсивность окраски на фотоэлектроколориметре при длине волны 690 нм (светофильтр красный). Концентрацию тирозина (мкмоль/мл) находят по
калибровочному графику.
Строят график изменения концентрации тирозина в пробе в зависимости от времени инкубации. На графике отмечают период времени, в течение которого скорость реакции находится в линейной зависимости от времени инкубации. Именно этот участок графика и будет
соответствовать условиям, при которых измеряется начальная скорость реакции. В пределах этого участка выбирают время инкубации,
которое необходимо использовать при дальнейших кинетических исследованиях этого фермента.
Опыт 3. Влияние концентрации трипсина
на скорость протеолитической реакции
Материалы и оборудование: казеин, 1 %-й раствор; 0,1 %-й
раствор фосфатного буфера (рН 8,0); ТХУ, 5 %-й раствор; трипсин,
5·10-4 %-й раствор в 0,005 моль/л растворе НСl; гидроксид натрия,
0,5 моль/л раствор; реактив Фолина – Чокальтеу; пипетки вместимостью 1, 2 и 5 мл; пробирки; конические воронки; фильтры; фотоэлектроколориметр; кюветы с толщиной слоя 0,5 см; термостат (40 °С).
В четырёх пробирках составляют инкубационные смеси, как указано в табл. 4.
Таблица 4
Состав инкубационных смесей
78
Трипсин следует добавить по возможности быстро, начиная
№ пробы
Концентрация фермента,
мкг/мл белка
Оптическая
плотность
Скорость реакции,
мкмоль/мин
1
2 3 4
с первой пробирки. После внесения фермента содержимое пробирок
перемешивают и инкубируют 15 мин при 40 °С.
Затем реакцию останавливают добавлением в каждую пробирку
3 мл ТХУ. Причём раствор ТХУ следует добавлять в том же порядке,
что и трипсин. Содержимое пробирок перемешивают, выпавший осадок фильтруют.
В фильтратах определяют концентрацию образовавшегося тирозина. Для этого отбирают из каждой пробы по 2,5 мл фильтрата в отдельные пробирки и добавляют по 0,5 мл реактива Фолина – Чокальтеу. Интенсивность окраски измеряют через 10 мин на фотоэлектроколориметре при длине волны 690 нм (светофильтр красный). Концентрацию тирозина (мкмоль/мл) находят по калибровочному графику.
Полученные результаты вносят в таблицу, выражая количество
фермента, внесённое в пробу, в мкг белка (исходить из того, что
для опыта был взят 5·10–4 %-й раствор трипсина). Эти результаты
можно перенести на график, откладывая скорость реакции (или единицы оптической плотности) на оси ординат, а концентрацию фермента – на оси абсцисс. Отмечают характер полученной зависимости
и делают выводы о характере влияния концентрации фермента
на скорость реакции. Результаты заносят в табл. 5.
Таблица 5
Изменение скорости реакции гидролиза казеина
в зависимости от концентрации фермента
на скорость реакции, катализируемой трипсином
Материалы и оборудование: казеин, 1 %-й раствор; 0,1 %-й рас-
твор фосфатного буфера (рН 8,0); ТХУ, 5 %-й раствор; трипсин;
Опыт 4. Влияние концентрации субстрата
79
5·10–4 %-й раствор в 0,005 моль/л растворе НСl, реактив Фолина –
№ пробы
Раствор
казеина, мл
Фосфатный
буфер, мл
Раствор
трипсина, мл
1
0,2
2,3
0,5
2
0,4
2,1
0,5
3
0,6
1,9
0,5
4
0,8
1,7
0,5
№ пробы
Концентрация субстрата,
мкмоль/мл
Скорость реакции,
мкмоль/мин 1
2
3
4
Чокальтеу; пипетки вместимостью 1, 2 и 5 мл; пробирки; конические
воронки; фильтры; фотоэлектроколориметр; термостат (37 оС).
В четырёх пробирках готовят инкубационные смеси, как показано
в табл. 6.
Таблица 6
Состав инкубационных смесей
Пробы тщательно перемешивают и оставляют в термостате
на 15 мин. Реакцию останавливают добавлением 3 мл раствора ТХУ.
Пробы перемешивают и фильтруют. В фильтрате определяют концентрацию тирозина.
Для этого отбирают из каждой пробы по 2,5 мл фильтрата в отдельные пробирки и добавляют по 0,5 мл реактива Фолина – Чокальтеу.
Интенсивность окраски измеряют через 10 мин на фотоэлектроколориметре при длине волны 690 нм (светофильтр красный). Концентрацию
тирозина (мкмоль/мл) находят по калибровочному графику.
Результаты записывают в табл. 7.
Таблица 7
Изменение скорости реакции гидролиза казеина
в зависимости от концентрации субстрата
Строят график зависимости скорости реакции от концентрации
субстрата. Объясняют характер полученной кривой.
80
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]