Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Промышленная микробиология. Лабораторный практикум
.pdf
O
OH
OH
OH
OH
CH2OH
O
OH
OH
OH
OH
O POOH
OH
O
OH
OH
OH
OP
O
OH
OH
O
OH
OH
O
OP
O
OH
OH
P
O
OH
OH
H OH
O
H
O P
O
OH
OH
O
O P
O
OH
OH
OH
H3PO
4
H OH
O P
O
OH
OH
OOP
O
OH
OH
H OH
O P
O
OH
OH
OH
O
H O
OH
OH
O
P
O
OH
OH
O
CH
2
OH
O
P
O
OH
OH
CH
3
OH
O
O
CH
3
OH
O
OH
Глюкоза
ATF
ADF
гексозокиназа
Глюкозо-6-фосфат
глюкозофосфат изомераза
Фруктозо-6-фосфат
фосфофруктокиназа
Фруктозо-1,6-дифосфат
ATF
ADF
Глицеральдегид3-фосфат
Дигидроксиацетон3-фосфат
NAD
+
NADH
1,3-Дифосфоглицерат
фруктозодифосфат альдолаза
глицеральдегид3-фосфат дегидрогеназа
ADF
ATF
фосфоглицерат киназа
3-Фосфоглицерат
фосфоглицерат мутаза
2-Фосфоглицерат
H2O
енолаза
Фосфоенолпируват
(ФЕП)
пируваткиназа
Пируват
лактатдегидрогеназа
NADH
NAD
+
Лактат
ADF
ATF
Рис. 2. Биохимия гомоферментативного молочнокислого брожения
11
O
OH
OH
OH
OH
CH2OH
O
OH
OH
OH
OH
O POOH
OH
O
OH
OH
OH
O POOH
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
O P
O
OH
OH
CH2OH
O
OH
OH
O P
O
OH
OH
Глюкоза
ATF
ADF
гексозокиназа
Глюкозо-6-фосфат
глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа
NADP+NADPH
Глюконолактон 6-фосфат
H2O
гдюконолактон гидратаза
6-Фосфоглюконат
6-фосфоглюконат дегидрогеназа
NADP+NADPH
CO
2
Рибулозо5-фосфат
Рис. 3. Окислительный этап пентозофосфатного пути
В окислительной части пентозофосфатного пути глюкозо-6-
фосфат подвергается окислительному декарбоксилированию, в результате которого образуются пентозы. Этот этап включает 2 реакции
дегидрирования [3].
Первая реакция дегидрирования – превращение глюкозо-6-фосфата в глюконолактон-6-фосфат катализируется NADP+-зaвиcимoй
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой и сопровождается окислением гидроксильной группы у первого атома углерода, с образованием одной
молекулы восстановленного кофермента NАDРH.
глюконат при участии фермента глюконолактонгидратазы.
реакцию дегидрирования окислительной части, в ходе которой происходит также и декарбоксилирование. При этом углеродная цепь
укорачивается на один атом углерода, образуется рибулозо-5-фосфат
и вторая молекула восстановленного NАDРН.
12
Далее глюконолактон-6-фосфат быстро превращается в 6-фосфо-
Фермент 6-фосфоглюконатдегидрогеназа катализирует вторую
CH2OH
O
OH
OH
O P
O
OH
OH
CH2OH
O
OH
OH
O P
O
OH
OH
CH2OH
O
OH
OH
O P
O
OH
OH
OH
O P
O
OH
OH
OH
OH
O
H
Рибулозо5-фосфат
Ксиулозо5-фосфат
рибулозо-5-фосфат 3-эпимераза
Рибулозо5-фосфат
Рибозо5-фосфат
рибулозо-5-фосфат изомераза
Рис. 4. Реакции превращения пентоз, катализируемые изомеразами
Неокислительный этап пентозофосфатного пути включает серию
обратимых реакций, в результате которых рибулозо-5-фосфат превращается в рибозо-5-фосфат и ксилулозо-5-фосфат, и далее за счёт
переноса углеродных фрагментов в метаболиты гликолиза – фруктозо-6-фосфат и глицеральдегид-3-фосфат. В этих превращениях принимают участие ферменты: эпимераза, изомераза, транскетолаза
и трансальдолаза. Транскетолаза в качестве кофермента использует
тиаминдифосфат. Неокислительный этап пентозофосфатного пути
не включает реакции дегидрирования и поэтому используется только
для синтеза пентоз.
Фермент рибулозо-5-фосфат-3-эпимераза изменяет стехиометрическое положение одной ОН-группы у третьего атома углерода, превращая рибулозо-5-фосфат в ксилулозо-5-фосфат. Другой фермент –
рибулозо-5-фосфат-изомераза катализирует превращение рибулозо-5-
Рибулозо-5-фосфат служит субстратом для двух ферментов.
13
фосфата в рибозо-5-фосфат. Рибозо-5-фосфат, образующийся
CH2OH
O
OH
OH
O P
O
OH
OH
OH
O P
O
OH
OH
OH
OH
O
H
OH
O P
O
OH
OH
O
H
OH
O P
O
OH
OH
OH
OH
OH
O
CH2OH
Ксиулозо5-фосфат
Рибозо5-фосфат
+
транскетолаза
тиаминдифосфат
Глицеральдегид 3-фосфат
+
Седогептулозо 7-фосфат
в неокислительной фазе, обеспечивает клетки рибозой, необходимой
для синтеза нуклеотидов, которые служат предшественниками
и структурными компонентами коферментов дегидрогеназ и нуклеиновых кислот [3].
Ферменты транскетолаза и трансальдолаза катализируют перенос
двух- и трёхуглеродных фрагментов, соответственно используя в качестве донора углеродных фрагментов кетозу, а альдозу – в качестве
акцептора. Эти реакции протекают в 2 этапа: сначала происходит отщепление углеродного фрагмента от молекулы-донора, а затем – перенос этого фрагмента на молекулу, выполняющую роль акцептора.
Транскетолаза в неокислительной фазе пентозофосфатного пути катализирует 2 реакции. В первой реакции транскетолаза расщепляет
связь С-С между кетогруппой и соседним атомом углерода в молекуле ксилулозо-5-фосфата, в результате чего кетоза превращается
в альдозу – глицеральдегид-3-фосфат, содержащую на 2 атома углерода меньше. Образующийся после расщепления двухуглеродный
фрагмент остаётся ковалентно связанным в каталитическом центре
фермента с коферментом тиаминдифосфатом. Далее фермент переносит двухуглеродный фрагмент на альдегидную группу альдозы – рибозо-5-фосфат, образуя новую кетозу – седогептулозо-7-фосфат [3].
Рис. 5. Реакция переноса, катализируемая транскетолазой
14
Трансальдолаза переносит трёхуглеродный фрагмент от седогеп-
OH
O P
O
OH
OH
O
H
OH
O P
O
OH
OH
OH
OH
OH
O
CH2OH
OH
O P
O
OH
OH
OH
O
H
OH
O P
O
OH
OH
OH
OH
O
CH2OH
Эритрозо4-фосфат
трансальдолаза
+
Глицеральдегид 3-фосфат
+
Седогептулозо 7-фосфат
Фруктозо6-фосфат
CH2OH
O
OH
OH
O P
O
OH
OH
OH
O P
O
OH
OH
OH
OH
O
CH2OH
OH
O P
O
OH
OH
OH
O
H
OH
O P
O
OH
OH
O
H
+
транскетолаза
тиаминдифосфат
Глицеральдегид 3-фосфат
+
Фруктозо6-фосфат
Эритрозо4-фосфат
Ксилулозо5-фосфат
тулозо-7-фосфата на глицеральдегид-3-фосфат, образуя эритрозо-4фосфат и фруктозо-6-фосфат. Эта реакция подобна реакции альдольного расщепления фруктозо-1,6-дифосфата гликолитического пути за
исключением того, что в данном случае трёхуглеродный фрагмент,
содержащий кетогруппу, переносится на альдозу – глицеральдегид-3фосфат, а в гликолитическом пути кетофрагмент высвобождается в
виде дигидроксиацетонфосфата.
дит перенос двухуглеродного фрагмента от ксилулозо-5-фосфата
на эритрозо-4-фосфат. Продуктами этой реакции являются фруктозо-
6-фосфат и глицеральдегид-3-фосфат.
Рис. 6. Реакция переноса, катализируемая трансальдолазой
В следующей реакции, катализируемой транскетолазой, происхо-
Рис. 7. Реакция переноса, катализируемая транскетолазой
15
Молочнокислые бактерии расщепляют ксилулозо-5-фосфат
CH2OH
O
OH
OH
O P
O
OH
OH
OH
O P
O
OH
OH
O
H
CH
3
OH
O
OH
CH
3
O
O
P
O
OH
OH
CH
3
OH
O
CH
3
H
O
OHCH
3
H3PO
4
Глицеральдегид 3-фосфат
Ксилулозо5-фосфат
Лактат
ATF ADF
Ацетат
Ацетилфосфат
NADH
NAD
+
NADH
NAD
+
Ацетальдегид
Этанол
Ф1
Ф2
Ф3
Ф4
на глицеральдегид-3-фосфат и ацетилфосфат (рис. 8).
Рис. 8. Заключительные реакции гетероферментативного
молочнокислого брожения:
Глицеральдегид-3-фосфат окисляется до молочной кислоты
по пути, аналогичному приведенному выше для гликолиза. Ацетилфосфат превращается в ацетат или восстанавливается до этанола
(некоторые гетероферментативные молочнокислые бактерии окисляют полученный этанол частично или полностью до ацетата) [3].
Таким образом, при гетероферментативном молочнокислом брожении образуется больше продуктов: молочная кислота, уксусная кислота, этанол, двуокись углерода.
Ф1 – ксилулозо-5-фосфаткетолаза; Ф2 – ацетаткиназа;
Ф3 – ацетальдегиддегидрогеназа; Ф – алкогольдегидрогеназа
16
Практическое использование молочнокислого брожения
Гомо- и гетероферментативные молочнокислые бактерии участвуют в таких биотехнологических процессах, как производство кисломолочных напитков, творога, сметаны, сыров, кислосливочного
масла, сырокопченых колбас. Они играют большую роль в квашении
плодов и овощей, силоса. Их широко используют в хлебопекарной
промышленности для приготовления жидких дрожжей, заквасок
для ржаного и пшеничного хлеба и в производстве молочной кислоты.
Для получения многих кисломолочных продуктов, в том числе
и сыров, чистые культуры молочнокислых бактерий вносят в пастеризованное молоко. Простокваша готовится при помощи молочнокислого
стрептококка (Str. lactis), являющегося мезофилом, ацидофилин – на за-
кваске, состоящей из термофильной культуры ацидофильной палочки
(Lb. acidophilus) и молочнокислого стрептококка (Str. lactis), кефир го-
товят на закваске, содержащей симбиотический комплекс из термофильных молочнокислых бактерий Lb. casei и дрожжей Saccharomyces
kefir, сбраживающих лактозу. Они входят в состав кефирных зерен,
представляющих собой плотные комочки казеина.
Имеются разнообразные национальные молочнокислые напитки
(кумыс, мацони, йогурт, биогурт, лебен и др.), которые получают заквашиванием кобыльего, верблюжьего, овечьего, козьего молока специфическими заквасками, содержащими термофильную болгарскую
палочку (Lb. bulgaricum).
Молочнокислые бактерии вместе с пропионовокислыми участвуют в процессе созревания сыров. Мезофильные молочнокислый
и сливочный стрептококки (Str. lactis и Str. cremoris) входят в состав заквасок для сметаны, творога, сливочного масла и маргарина,
в последнем случае для придания аромата продуктам используются
ароматобразующие виды (гетероферментативные стрептококки –
Str. diacetilactis).
Гетероферментативным молочнокислым бактериям L. Brеvis, наряду с гомоферментативными бактериями L. plantarum в симбиозе с
17
дрожжами, принадлежит основная роль при изготовлении ржаного
хлеба. Они разрыхляют тесто, придают ему специфический аромат
и кисловатый вкус. Гомоферментативные термофильные молочнокислые бактерии применяют для приготовления жидких дрожжей
в хлебопечении (Lb. delbrueckii).
Квашение овощей и силосование кормов сводятся в основном
к молочнокислому брожению этих субстратов с помощью гомоферментативных мезофилов Lb. plantarum.
Гомоферментативные молочнокислые бактерии (Lb. delbrueckii
и Str. lactis) применяют в производстве молочной кислоты, которая
используется в консервной, кондитерской промышленности, в производстве безалкогольных напитков, в медицине. Некоторые из них
образуют антибиотик низин.
Молочнокислые бактерии включают в разные композиции профилактических и лечебных препаратов: бифидумбактерин, бификол,
колибактерин, лактобактерин. Первый из них состоит из живых высушенных бифидобактерий определенного штамма, второй – из живых бифидобактерий (штамм 1) и кишечной палочки (штамм М-17),
третий содержит живые кишечные палочки штамма М-17, четвертый
представляет собой сочетание лиофильно высушенных лактобацилл
(Lb. fermenti и Lb. plantarum) [1].
Многие мезофильные гетероферментативные палочковидные
бактерии и лейконосток являются вредителями в производстве спирта, пива, вина, безалкогольных напитков, сахара и др.
Вопросы к коллоквиуму
1. Дайте определение понятию «процесс брожения».
2. В чем отличие гомоферментативного брожения от гетероферментативного?
3. Перечислите характерные особенности молочнокислых бактерий.
4. Перечислите основные семейства и роды молочнокислых бактерий,
имеющих промышленное значение.
5. Дайте характеристику основных молочнокислых бактерий.
18
6. Прокомментируйте схему гомоферментативного молочнокислого бро-
жения, назовите исходное соединение, основные промежуточные соединения
и участвующие в этих процессах ферменты.
7. Прокомментируйте схему гетероферментативного молочнокислого
брожения, назовите основные промежуточные и конечные соединения и
участвующие в этих процессах ферменты.
8. Назовите основные сферы практического использования молочно-
кислого брожения.
19
Лабораторная работа № 1
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЕ ПОЛУЧЕНИЕ
ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ
СИНТЕЗ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ
Цель: познакомиться с промышленным получением молочной
кислоты микробиологическим методом, продуцентами молочной кислоты.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Молочная кислота (СН3СНОНСООН) – органическая однооснов-
ная кислота с гидроксильной группой во втором положении. Образуется в результате анаэробного превращения углеводов молочнокислыми
бактериями. В 1847 г. С. Блодно доказал, что данная кислота является
продуктом брожения, а Л. Пастер установил, что этот процесс вызывают бактерии. Молочная кислота с 1881 г. производится промышленным
способом с помощью молочнокислых бактерий. В СССР было организовано производство молочной кислоты в 1923 г.
Образование молочной кислоты из глюкозы возможно несколькими путями. При сбраживании гомоферментативными молочнокислыми бактериями:
С6Н12О6 → 2 СН3СНОНСООН + 2 CO2
Второй путь, гетероферментативный, включает образование
не только молочной кислоты, но и других продуктов (уксусная кислота, этанол, углекислый газ):
С6Н12О6 → СН3СНОНСООН + CH3COOH + CH3CH2OH + CO2.
Для промышленного получения молочной кислоты используют
гомоферментивные молочнокислые бактерии (рис. 9). У гомоферментных молочнокислых бактерий только 3 % субстрата превраща-
20
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]