Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Промышленная микробиология. Лабораторный практикум
.pdf
ческой и энзиматической трансформации. Получение этих БАВ позволяет существенно повысить рентабельность производства кормового белка.
С точки зрения последовательности выделения указанных выше
фракций стали уже традиционными технологии, предполагающие
на первом этапе выделение фракций (компонентов) нуклеиновых кислот (РНК из биомассы дрожжей, РНК и ДНК из биомассы бактерий),
а на втором этапе – фракции белковых веществ. Образующиеся при
этом жидкие отходы (растворы солей, органического растворителя)
стараются утилизировать в основном производстве или на стадии
культивирования штаммов-микроорганизмов, а твердые – в виде отработанной биомассы микробных клеток – в производстве препаратов
кормового назначения. Такой подход позволяет реализовать малоотходную схему производства с замкнутым циклом водоснабжения [5].
Технология комплексной переработки дрожжей
Культивирование продуцентов. Процесс образования липидов
у большей части дрожжей состоит из двух ярко выраженных стадий:
быстрое образование белка и медленное накопление липидов,
прежде всего фосфоглицеридов и нейтральных жиров;
прекращение роста дрожжей и накопление липидов (в основ-
ном нейтральных).
Поэтому к дрожжам предъявляется требование быстро расти
на различных субстратах, давая высокий выход биомассы, и накапли-
вать значительное количество липидов в обычных для культуры условиях [5].
Этому требованию в той или иной степени удовлетворяют отдельные виды дрожжей родов Rhodotorulla, Lypomyces, Cryptococcus,
Candida, причем наиболее полно удовлетворяет указанному требованию Cryptococcus terricolus. Он образует до 60 % липидов. Его отличает способность синтезировать липиды на первых же стадиях развития, когда происходит блокирование ферментных систем, ответственных за синтез аминокислот, и дрожжи полностью переходят
на биосинтез жирных кислот и липидов.
41
Дрожжи вида Lipomyces lipoferus также способны накапливать
до 60 % липидов (из них 77 % составляют ацилглицериды, применяемые в качестве смазок, 3 % фосфолипиды и около 10 % свободных
жирных кислот). Эти дрожжи хорошо растут на различных субстратах (гидролизаты древесины и торфа) [5].
Дрожжи рода Candida широко используются для получения
микробного белка, но способны накапливать до 20 % липидов, которые отличаются богатым составом жироподобных веществ. Доля
фосфолипидов может составлять до 50 % от общей массы липидов,
тогда как для других видов дрожжей эта величина обычно не превышает 3–5 % [5].
В качестве продуцентов липидов изучены микроскопические
грибы родов Aspergillus и Penicillium. Выделены штаммы Geotrichum
candidum (lactis), образующие до 50 % липидов. В состав липидов
грибов входят, главным образом, ацилглицериды и фосфолипиды, что
близко по составу к растительным жирам. Однако широкого распространения грибы-продуценты липидов пока не получили [5].
Для их выращивания стараются использовать то же сырье, что
и при производстве кормового белка: гидролизаты растительного сырья, торфа, н-парафины, нефтяные дистилляты.
Выход дрожжей, состав и количество синтезируемых липидов
во многом зависит от состава питательной среды и прежде всего
от источника углерода и энергии. Выбор источника углерода оказывает влияние на состав липидов. Это особенно проявляется при использовании углеродсодержащих соединений, являющихся компонентами липидов. Например, использование вместо сахарозы олеиновой кислоты при культивировании С. tropicalis увеличивает содержание ее в липидах в 12 раз, содержание общих липидов возрастает в 2–
4 раза, свободных жирных кислот – в 11 раз, триглицеридов – в 6 раз.
Это связано с тем, что микроорганизмы могут использовать жирные
кислоты для биосинтеза липидов без предварительного карбоксилирования, что снижает энергетические затраты клетки.
42
Источники азота в основном принимают участие в конструктивном
обмене клетки и не оказывают прямого влияния на биосинтез липидов.
Для осуществления биосинтеза липидов стараются использовать легко
ассимилируемые источники азота: мочевину, аммонийные соли.
Важное значение имеет соотношение азота и углерода в среде,
которое определяет преимущественное направление биосинтеза,
а именно:
1) понижение концентрации азота в среде при нормальном обес-
печении углеродом вызывает увеличение липидообразования, а избыточный азот (при дефиците углерода) приводит к снижению выхода
биомассы и незначительному накоплению липидов;
2) повышенные концентрации азота вызывают снижение липидо-
образования у микроорганизмов.
Обычно оптимальное соотношение N:C тем больше, чем труднодоступнее источник углерода. Например, при культивировании
дрожжей рода Candida на углеводородах оно составляет 1:30, а на углеводах 1:40.
Микроорганизмы-продуценты липидов нуждаются в источнике
фосфора, макро- и микроэлементов и факторах роста. При избытке
фосфора происходит повышенный биосинтез белка, а при недостатке
усиливается липидообразование, но снижается степень усвоения субстрата [5].
Условия культивирования
Влияние аэрации. Предполагают, что растворенный в среде ки-
слород тормозит действие фермента липазы, что способствует биосинтезу липидов. Однако факт прямого влияния кислорода на процесс липидообразования пока не установлен, но доказана связь концентрации растворенного кислорода с соотношением липидных фракций, в аэробных условиях в основном образуются предшественники
эргостерина (сквален), а в анаэробных условиях в основном синтезируются стерины и жирные кислоты.
43
При недостатке кислорода происходит резкое торможение синтеза триацилглицеридов и образование нетипичных для микроорганизма липидов. Одновременно наблюдается увеличение относительного
содержания фосфоглицеридов, что связано с их функциональными
свойствами (они ответственны за дыхание клеток). При избытке кислорода возрастает относительное количество ненасыщенных жирных кислот в микробном жире.
Влияние pH среды. Небольшие изменения pH среды незначительно изменяют суммарное количество липидов в клетке, но сильно влияют на их качественный состав. Например, при культивировании дрожжей Сandida maltosa в интервале pH 3–6 выход биомассы практически
не меняется. При снижении pH наблюдается возрастание доли ненасыщенных жирных кислот с 26 до 39 %. При увеличении pH среды снижается содержание фосфоглицеридов и свободных жирных кислот.
Влияние температуры. Температурный режим в основном оказывает влияние на состав синтезируемых липидов. Установлено, что с понижением температуры наблюдается ускорение синтеза жирных кислот. Любое отклонение температурного режима от оптимального приводит к увеличению образования триацилглицеридов и снижению образования фосфоглицеридов. Таким образом, регулируя температуру,
pH среды и аэрацию при культивировании дрожжей-продуцентов липидов, можно получать липидные фракции заданного состава.
Влияние субстрата. Культивирование на гидролизатах торфа
и древесины. Схема получения микробной биомассы для выделения
липидов в целом такая же, как и при получении кормового белка. Однако на отдельных стадиях технологического процесса имеются
некоторые особенности.
Так, для выращивания дрожжей рода Lypomyces, Cryptococcus
большое значение имеет подготовка гидролизатов, касающаяся способа его нейтрализации. Установлено, что для обеспечения в питательной среде соотношения N:C 1:40 наиболее эффективна двухступенчатая нейтрализация гидролизата: до pH 4,0 известковым молоком, а затем – до pH 6,0 аммиачной водой. В этом случае экономиче-
44
ский коэффициент достигает 61 %. Кроме того, интенсивная аэрация
при нейтрализации гидролизата способствует коагуляции и более
полному удалению веществ лигногуминового комплекса, что улучшает качество гидролизата.
Чтобы повысить количество потребляемого субстрата рекомендуется разбавление гидролизатов до содержания редуцирующих веществ (РВ) до 1,0–2,0 %. За счет этого происходит уменьшение периода лаг-фазы роста культуры. Выход биомассы достигает 60 % от
используемых РВ. Применение разбавленных субстратов оказывает
влияние на образование насыщенных жирных кислот: с уменьшением
концентрации РВ накопление ненасыщенных жирных кислот возрастает. Например, при содержании РВ 4,0 % накапливается 64 % ненасыщенных жирных кислот, а при 1 % – уже 75 %.
Указанные выше дрожжи способны накапливать: на гидролизатах
торфа – 38–39 % липидов; на гидролизатах древесины – 39–40 % липидов, а на смешанных субстратах – до 51 %. Было показано, что
максимальная концентрация липидов (51 %) и большой выход биомассы (до 10 г/л) достигается при соотношении объемов гидролизата
древесины к гидролизату торфа 4:1.
С повышением доли гидролизата торфа в питательной среде увеличивается содержание лигногуминовых веществ, что вызывает торможение биосинтеза липидов. С увеличением доли гидролизата древесины происходит повышенное образование линолевой кислоты, что
связано со специфическим влиянием ксилоз. Установлено, что в оптимальных условиях из 1 т торфа можно получить 50–70 кг липидов.
Для культивирования на углеводородных субстратах нельзя использовать традиционные липидообразующие штаммы дрожжей,
так как они не способны потреблять углеводороды. Поэтому в этом
случае для получения липидов используют парафинутилизирующие
дрожжи вида Candida maltosa, которые при культивировании на углеводородных субстратах накапливают липидов даже больше, чем
при культивировании на углеводах. Так, при использовании в качестве источника углерода углеводородов происходит увеличение
45
в 4–8 раз количества синтезируемых фосфоглицеридов и снижение
количества триацилглицеридов.
На качественный состав липидов и их выход оказывает влияние
молекулярно-массовый состав углеводородов в питательной среде.
При использовании фракции парафинов С12–С16 происходит увеличение содержания фосфоглицеридов до 50 %. Небольшое расширение
фракции парафинов до С17–С18 приводит к двукратному увеличению
содержания триацилглицеридов при одновременном уменьшении содержания фосфоглицеридов. Субстраты с молекулярной массой
меньше С12 способствуют уменьшению количества липидов в клетке.
Для производства липидов в клетке дрожжи на углеводородном
субстрате могут выращиваться как по специальному жировому режиму (соотношение N:C равно 1:30), так и по белковому (N:C равно
1:15). В липидах дрожжей, выращенных по белковому режиму, содержится в 3 раза больше фосфоглицеридов, в 4 раза больше стеринов, в 2 раза меньше моно- и диацилглицеридов и свободных жирных
кислот, чем в дрожжах, выращенных по жировому режиму. Дрожжи,
выращенные по жировому режиму, синтезируют больше ненасыщенных жирных кислот.
Для того чтобы получать дрожжи с высоким содержанием различных групп липидов была разработана технология культивирования белково-жировых дрожжей по двухстадийному непрерывному методу:
1) выращивание микробных клеток в белковом режиме с началь-
ным содержанием парафина в среде 1 %;
2) «ожиривание» дрожжей на среде с содержанием 1,2 % парафи-
нов и недостатком азота.
При таком способе культивирования готовые дрожжи содержат 30–
49 % белковых веществ, 16–18 % жиров и 3,5–4,5 % остаточных углеводородов. От общего количества липидов на долю моно- и диацилглицеридов приходится 2,5–6,0 %, стеринов – 1,0–1,5 %, эфиров стеринов и
восков – 0,5–4,0 %, свободных жирных кислот – 3,5–22,0 %, фосфолипидов – 18–50 %. Недостатком такой технологии культивирования дрожжей является большое время биосинтеза и необходимость установки дополнительного ферментационного оборудования.
46
Полученные в результате биосинтеза дрожжи концентрируют
и высушивают по технологии производства кормового продукта
и передают на переработку, которую начинают со стадии выделения
биожира.
Выделение экстракционного биожира и фосфолипидов
Микробные жиры выделяют из биомассы дрожжей экстракцией
органическим растворителем (бензином). Дрожжи высушивают, гранулируют и подвергают экстракции. Обезжиренную биомассу (биошрот) направляют на дальнейшую переработку. Из полученного
на стадии экстракции раствора микробных липидов – мисцеллы – отгоняют растворитель. Полученный биожир представляет собой коричневую или темно-коричневую вязкую почти застывшую массу.
Имеет плотность 890–950 кг/м3. Содержит около 30 % фосфолипидов
и 45 % неомыляемых веществ.
Такой биожир может быть переработан с получением пяти продуктов: технологической смазки на основе ацилглицеридов; концентрата фосфолипидов; жирных кислот; эргостерина; убихинона.
Выделение фосфолипидов основано на их малой растворимости
в ацетоне. Микробный жир обрабатывают ацетоном при соотношении 1:5 (по объему). Нерастворившиеся фосфолипиды отделяют,
подвергают вакуумированию для удаления остатков ацетона и затем
смешивают с минеральным маслом. Концентрат фосфолипидов представляет собой темноокрашенную жидкость со специфическим запахом, содержащую 40–60 % основного вещества, 2,5 % неомыленных
веществ, 20–40 % минерального масла, белковые вещества в нем
должны полностью отсутствовать.
Ацетоновая мисцелла после выделения фосфолипидов представляет собой сложный раствор, в состав которого входят свободные жирные
кислоты (СЖК), жиры, углеводороды. Если биосинтез дрожжей проводят на н-парафинах, то ее направляют на получение СЖК.
47
Выделение свободных жирных кислот
и получение технологической смазки
Ацетоновую мисцеллу, полученную после выделения фосфолипидов, смешивают с 50 %-м раствором гидроксида калия, что обеспечивает нейтрализацию СЖК с образованием суспензии мыл. Мыла
отфильтровывают на барабанном вакуум-фильтре и промывают ацетоном. Фильтрат (раствор нейтрального жира в ацетоне) поступает
дальше для выделения технологической смазки. Мыла растворяют
в воде при температуре 80 °С, затем добавляют серную кислоту. Осадок жирных кислот отделяют и подвергают дистилляции. Дистилляцию жирных кислот проводят при 210 °С при остаточном давлении
2–3 мм рт. ст. Вначале отделяют низкомолекулярные фракции
(до С10), затем отгоняют фракцию СЖК, которая представляют собой
жидкость светло-желтого цвета со слабым специфическим запахом,
содержат основную фракцию С14–С16. Они характеризуются следующими показателями:
кислотное число – 198–210 мг КОН/г;
эфирное число – не более 3,0 мг КОН/г;
содержание неомыленных веществ – не более 2,0 %;
йодное число – не более 55 г йода/100 г продукта;
содержание золы – не более 0,02 %;
содержание воды – не более 0,2 %.
Ацетоновую мисцеллу после отделения мыл направляют на получение технологической смазки. Ацетон отгоняют, остаток вакуумируют при остаточном давлении 125 мм рт. ст. и подвергают дезодорации (отдувка дурнопахнущих веществ) при 210–230 °С и остаточном давлении 3–5 мм рт. ст. подачей перегретого до 230 °С водяного пара. В результате получается технологическая смазка, представляющая собой вязкую жидкость от светло-коричневого до коричневого цвета со специфическим запахом, содержащую до 2 % фосфолипидов, до 0,05 % золы и имеющую число омыления не менее
175 мг КОН/г.
48
Выделение эргостерина и убихинона
Выделение эргостерина и убихинона проводят после отделения
СЖК. Из ацетоновой мисцеллы после отделения фосфолипидов отгоняют растворитель. Свободный от растворителя жир для отделения
неомыляемой фракции, содержащей эргостерин и убихинон, от омыляемой подвергают омылению с помощью раствора гидроксида калия
и пирогаллола в метаноле. Омыление проводят при 64 °С и соотношении жир : метанол : едкое кали : пирогаллол 10:20:2:0,2 в течение
1 ч, затем раствор разбавляют водой. Водный раствор многократно
(3–5 раз) экстрагирую эфиром. Из водного раствора выделяют СЖК
аналогично описанному ранее способу.
Для выделения эргостерина и убихинона из эфирного раствора
отгоняют растворитель. Остаток растворяют в петролейном эфире
в соотношении 1:1. Затем отгоняют 50–60 % петролейного эфира
для очистки от растворимых легколетучих примесей и охлаждают
до температуры 15 °С, выдерживают в течение 2 ч при этой температуре. Выпавший осадок эргостерина отделяют на вакуум-фильтре.
Кристаллы промывают на фильтре холодным петролейным эфиром
и сушат в вакуум-сушильном шкафу. Эргостерин-сырец – аморфный
порошок белого или сероватого цвета со специфическим запахом
и содержанием основного вещества не менее 65 %.
Из фильтрата отгоняют петролейный эфир, остаток растворяют
в ацетоне (1,0:2,5 по объему), полученный раствор выдерживают 2 ч
при -10 °С, после чего выпавшие кристаллы углеводородов отфильтровывают на вакуум-фильтре. Вымораживание углеводородов необходимо, так как большое содержание углеводородов в неомыляемой
фракции затрудняет выделение убихинона методом хроматографического разделения. Из фильтрата отгоняют ацетон, остаток направляют
на хроматографическое выделение убихинона. После хроматографического разделения концентрат убихинона направляют на окончательную очистку. Концентрат убихинона (перед очисткой) – вязкая
жидкость темно-коричневого или черного цвета со специфическим
49
запахом и содержанием убихинона не ниже 10 %. Убихинон после
очистки – кристаллический порошок ярко-желтого или желтооранжевого цвета с содержанием примесей не более 5 % и температурой плавления 42–44 °С.
Получение продуктов полинуклеотидной природы
из обезжиренного микробного сырья
Клетки дрожжей рода Candida – продуценты кормового белка –
содержат 7–11 % от массы суммарных нуклеиновых кислот, из которых на долю РНК приходится 90 %.
В биомассе бактерий уровень полинуклеотидов может достигать
21 %, причем РНК и ДНК присутствуют в сопоставимых количествах.
Среди компонентов нуклеиновых кислот наиболее просто извлекать РНК методами, не требующими специальной обработки клеток.
ДНК, наоборот, удается извлечь из бактерий только после обработки
биомассы растворами фенола, детергентами или органическими растворителями. Считается, что ДНК в клетке бактерий заблокированы
липидами. Исключение составляют некоторые бактерии, например
водород- и метанокисляющие. Последние представляют наибольший
интерес, поскольку являются промышленными продуцентами кормового белка на природном газе. В России для этого использовали
штаммы бактерий Methylococcus capsulatus [5].
Промышленное производство РНК из дрожжей основано на применении метода экстракции из нативных или высушенных клеток.
Сложность выделения РНК из биомассы состоит в том, что она в клетке
связана в комплекс с белками, так называемый белково-нуклеиновый
комплекс (БНК) или нуклеопротеид, в виде которого она и переходит
в раствор экстракта. При получении РНК нуклеопротеид должен быть
разрушен химическими или энзиматическими методами. Наиболее часто используют разбавленные растворы гидроксидов аммония или натрия. Для этого проводят щелочную экстракцию РНК при концентрации клеток дрожжей в суспензии не более 8–10 %, pH 8,5–9,0 и темпе-
50
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]