Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Промышленная микробиология. Лабораторный практикум
.pdf
присутствие в цитозоле АДФ, то есть при избытке в клетке АТФ
(и недостатке АДФ) её скорость снижается. Поскольку АТФ, не под-
вергающийся метаболизму, в клетке не депонируется, а просто разрушается, то эта реакция является важным регулятором гликолиза [3].
8. Изомеризация 3-фосфоглицерата в 2-фосфоглицерат
Данная реакция сопровождается внутримолекулярным переносом
оставшейся фосфатной группы, и 3-фосфоглицериновая кислота превращается в 2-фосфоглицериновую кислоту (2-фосфоглицерат):
Реакция обратима, протекает в присутствии ионов Mg2+. Кофактором фермента является 2,3-бифосфоглицериновая кислота, аналогично тому, как в фосфоглюкомутазной реакции роль кофактора выполняет глюкозо-1,6-дифосфат [3].
9. Дегидратация 2-фосфоглицерата с образованием фосфо-
енолпирувата
Эта реакция катализируется енолазой, при этом 2-фосфоглицерат
в результате отщепления молекулы воды переходит в фосфоенолпируват (ФЕП), а фосфатная связь в положении 2 становится высокоэргической:
Енолаза активируется двухвалентными катионами Mg2+ или Mn2+
и ингибируется фторид-ионом [3].
31
10. Перенос фосфатной группы с фосфоенолпирувата на АДФ
Десятая реакция характеризуется разрывом высокоэргической связи и переносом фосфатного остатка от ФЕП на АДФ (субстратное фосфорилирование). Реакция катализируется ферментом пируваткиназой:
Для действия пируваткиназы необходимы ионы Mg2+, а также
одновалентные катионы щелочных металлов (K+ или др.). Внутри
клетки реакция является практически необратимой.
Рассмотрев более детально несколько типов брожения, можно убедиться в том, что соблюдается эквивалентность между количеством
молекул НАДН, образованных в ходе гликолиза, и числом молекул
НАД+, сформировавшихся в ходе собственно брожения (при условии,
что в метаболизме не принимает участие молекулярный кислород). Таким образом, в анаэробных условиях использующие бродильный тип
метаболизма клетки вынуждены тратить существенную часть двух-,
трехуглеродных органических веществ для акцептирования водорода,
выводя их затем из клетки. Этот крайне непроизводительный процесс
приводит к тому, что в анаэробных условиях клетки перерабатывают
огромные количества субстрата, чтобы извлечь нужное для жизнедеятельности количество энергии. Неслучайно у многих факультативно анаэробных микроорганизмов выработался механизм подавления
процессов брожения в аэробных условиях с переключением на дыхательный метаболизм. При дыхании из одной молекулы глюкозы клетка
может извлечь максимально 38 молекул АТФ, а при брожении – только
4 (в большинстве случаев всего 2) [3].
32
Спиртовое брожение
Преобладающим продуктом спиртового брожения является этанол. Этот тип брожения характерен для определенных видов дрожжей, бактерий, а также мицелиальных грибов. Известно 3 основных
способа спиртового брожения, которые отличаются друг от друга
тем, какой из трех катаболических путей расщепления глюкозы
(и некоторых других углеводов) реализуется: гликолиз, пентозофосфатные пути или 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатный (КДФГ)
путь (путь Энтнера – Дудорова). Наиболее часто, как отмечалось выше, клетки используют гликолиз и его конечный продукт – пируват
чаще других служит субстратом спиртового брожения [3].
На рис. 10 представлены схемы двух способов спиртового брожения.
Первый способ предполагает катаболизм глюкозы по гликолитическому пути (характерен для дрожжей и бактерий Sarcina ventriculi),
а второй – по пентозофосфатному (гетероферментативные молочнокислые бактерии). Соответственно различаются участвующие в этих
процессах ферменты и спектр продуктов. Третий способ спиртового
брожения, который используют бактерии Zymomonas mobilis, отличается тем, что глюкоза катаболизируется по пути Энтнера – Дудорова.
Образующийся пируват подвергается декарбоксилированию, как
и в первом случае, и ступенчато восстанавливается в этанол. Часть
пирувата восстанавливается в молочную кислоту.
На рис. 10 продемонстрировано, что количество затраченных
в ходе гликолиза и пентозофосфатного пути молекул НАД+ (НАДФ+)
строго соответствует количеству регенерированных в процессе спиртового брожения молекул НАД+ (НАДФ+). При этом реакции субстратного фосфорилирования, приводящие к синтезу АТФ, имеют
место только в катаболических путях до образования пирувата. В реакциях собственно спиртового брожения, связанных с преобразованием пирувата в этанол или лактат, запасание энергии не происходит.
33
O
OH
OH
OH
OH
CH2OH
CH
3
OH
O
O
CH
3
H
O
CH
3
OH
Глюкоза
2 ATF
2 ADF
Пируват
4 ATF
4 ADF
2
2
2
2 СO
2
2 NAD
+
2 NADH
H OH
O
H
O P
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
CH2OH
CH2OH
O
OH
OH
O P
O
OH
OH
CH
3
O
O
P
O
OH
OH
CH
3
H
O
OHCH
3
CO
2
CH
3
OH
O
OH
CH
3
OH
O
O
Глицеральдегид 3-фосфат
Ксилулозо5-фосфат
Ацетилфосфат
Ацетальдегид
Этанол
NADP
+
NADP
+
NADPH
NADPH
2 ATF
2 ADF
Лактат
Пируват
NAD
+
NAD
+
NADH
NADH
2 ATF
2 ADF
ционируют клетки. Кроме того, у некоторых микроорганизмов существуют отдельные отклонения от приведенных выше классических
схем спиртового брожения. В результате спектр продуктов брожения
может сильно различаться и включать, кроме этанола и лактата, при-
Рис. 10. Схемы двух путей спиртового брожения с расщеплением
глюкозы по гликолитическому (через пируват) пути
и по пентозофосфатному (через ксилулозо-5-фосфат) пути
Ход брожения очень сильно зависит от условий, в которых функ-
34
меси: глицерин, ацетальдегид, другие альдегиды, эфиры, кетоны,
спирты, в том числе высшие органические кислоты и др. [3].
Вопросы к коллоквиуму
1. Дать характеристику процесса брожения. Его роль в энергетическом
катаболизме?
2. Какие виды брожения известны? Дать их краткую характеристику.
3. Описать процесс гликолиза глюкозы. Дать характеристику отдельных
стадий гликолиза.
4. По каким еще процессам может происходить катаболизм глюкозы?
5. Описать заключительные стадии спиртового брожения.
35
Лабораторная работа № 2
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЕ ПОЛУЧЕНИЕ
РАСТВОРИТЕЛЕЙ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ЭТАНОЛА
Цель: познакомиться с микробиологическим процессом получе-
ния этанола из зернового сырья.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Материалы и оборудование: лабораторная мельница; сито диа-
метром 1 мм; стакан для замеса; весы; воронка Бюхнера; колба Бунзена; матерчатый фильтр; колба объемом 500 мл; гидрозатвор; набор
спиртометров; перегонная установка (испарительная колба на 500 мл,
насадка, термометр, нисходящий холодильник, алонж, приемный цилиндр); раствор гидроксида натрия концентрацией 1 моль/л; индикаторная бумага.
Ход работы
1. Приготовление осахаренного сусла
1.1. Приготовление помола зерна
Для приготовления помола зерна необходимой степени измельчения проводится неоднократное измельчение зерна с последующим
рассевом на ситах разного диаметра. Помол зерна производят на лабораторной мельнице так, чтобы все размолотое зерно (помол)
при просеивании прошло через сито с отверстиями диаметром 1 мм.
1.2. Приготовление замеса
Приготовление замеса заключается в смешивании измельченного
сырья с водой в определенном соотношении, которое называется гидромодуль замеса. В данной лабораторной работе готовится высоко-
36
концентрированный замес с гидромодулем 1:2,5. В 250 мл воды температурой 45–50 °С вносится 20 г размолотого ячменного солода и
80 г помола зерна. Замес тщательно перемешивается в течение 30 мин
при температуре 45–52 °С – для расщепления крахмала; 30 мин
при температуре 62–63 °С – для образования мальтозы; 30 мин при
температуре 70–72 °С – для осахаривания крахмала; 30 мин при температуре 76–78 °С – для доосахаривания крахмала. Полученный затор
фильтруют через матерчатый фильтр на воронке Бюхнера и промывают водой до общего объема 250 мл.
1.3. Приготовление дрожжевой разводки
Для сбраживания осахаренного сусла используют чистую культуру дрожжей, сухие спиртовые дрожжи или прессованные хлебопекарные. Используемые дрожжи должны обладать высокой бродильной способностью, содержать не более 3 % мертвых клеток и не давать нарастания кислотности.
Прессованные хлебопекарные дрожжи необходимо развести
в 30 мл осахаренного сусла температурой 30 °С из расчета 2–2,5 г
дрожжей на 250 мл сусла. Через 20 мин дрожжевую суспензию внести в осахаренное сусло.
Сухие спиртовые дрожжи необходимо реактивировать следующим образом (в расчете на 1000 мл осахаренного сусла). Следует
взять: 20 мл воды температурой 30 °С; 1 г сахара; 0,5 г сухих дрожжей. Приготовленный раствор поставить на качалку на 30 мин
и выдержать при температуре 30 °С в течение 1 часа. Приготовленную дрожжевую разводку внести в осахаренное сусло.
2. Брожение
Сусло с внесенной дрожжевой разводкой переливается в колбу
на 500 мл, закрывают гидрозатвором и ставят в термостат. Брожение
проводится при температуре 30 °С в течение 48–72 ч.
37
2.1. Определение концентрации спирта
Полученную после окончания брожения бражку фильтруют через
матерчатый фильтр, помещают в колбу и нейтрализуют раствором
гидроксида натрия до рН 7 (по индикаторной бумаге). Нейтрализованную бражку заливают в испарительную колбу, собирают установку для перегонки. Приемную колбу помещают в баню со смесью льда
и воды. Перегонку ведут до температуры 99–100 °С. Собранный отгон переливают в мерный цилиндр, опускают спиртометр (ареометр,
проградуированный в % об.) и по шкале в % об. устанавливают крепость полученного отгона. Этиловый спирт, полученный в результате
перегонки бражки, вместе с сопутствующими летучими примесями
(эфирами, альдегидами, кислотами и высшими спиртами) называется
спирт-сырец. В результате очистки этилового спирта-сырца от сопутствующих летучих примесей с помощью ректификации получают
спирт этиловый ректификованный.
38
ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ
Выделение эргостерина
и убихинона
Получение
технологической смазки
Выделение
жирных кислот
Выделение
фосфолипидов
Биошрот
Биошрот
Получение белковых гидролизатов,
концентратов и изоля тов
Культивирование микроорганизмов
Отделение биомассы от
культуральной жидкости
Экстракция биожира
Получение фракции ДНК и РНК
Гидролиз микробных ДНК и РНК
Выделение рибонуклуозидов
Получение гуанозина,
гуанина и D-рибозы
Панкреатический
гидролизат РНК
Получение уридина
Получение аденозина,
аденина и инозина
Получение
цитидина
Получение
аденозинфосфатов
К КОЛЛОКВИУМУ № 3
Рис. 11. Схема комплексной переработки биомассы микроорганизмов
39
Приведенная схема комплексной переработки биомассы промышленных микроорганизмов (рис. 11) в равной мере применимы как в отношении дрожжей, так и бактерий. Однако клетки бактерий, в отличие
от дрожжей, содержат то же количество нуклеиновых кислот – 7–12 %.
Если из них удалить нуклеиновые кислоты, то представляется
возможным сократить число технологических операций, связанных
с выделением белковых веществ, и получать в процессе комплексной
переработки указанную гамму продуктов на основе микробных липидов и нуклеиновых кислот и белковый концентрат с содержанием
белковых веществ не ниже 80 %. Кроме того, бактерии отличаются
от дрожжей и соотношением внутриклеточных РНК и ДНК. Это позволяет наряду с полирибонуклеотидами получать и полидезоксирибонуклеотиды, а из них, в первую очередь, тимидин как полупродукт
для синтеза противовирусных лекарственных средств. Следует иметь
в виду, что ДНК бактерий, как правило, связана в комплекс не только
с белками, но и с липидами. Поэтому схема комплексной переработки
биомассы бактерий должна предусматривать первоначальное обезжиривание клеток, что в дальнейшем облегчает извлечение из них
полидезокси-рибонуклеотидов [5].
Комплексная переработка биомассы микроорганизмов с получением различной природы и назначения препаратов в совместном производстве кормового биошрота не отличается высокой рентабельностью. Производить липидные препараты необходимо в отдельном специально оборудованном пожаро- и взрывобезопасном
помещении (цехе) при наличии соответствующего оборудования
и подготовленного персонала, так как процесс выделения липидов
связан с использованием легкокипящих растворителей.
Иной подход предусматривает переработку биомассы промышленных микроорганизмов с выделением водорастворимых компонентов микробных клеток, каковыми являются белки и нуклеиновые кислоты. При этом вариант комплексной переработки микробного сырья предполагает не только выделение и очистку данных соединений,
но и получение на их основе более дорогостоящих продуктов хими-
40
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]