Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Промышленная микробиология. Лабораторный практикум
.pdf
ратуре 80–90 °С в течение 45–60 мин. При этом в жидкую фазу переходит БНК, содержащий 50–70 масс. % полирибонуклеотидов. После
экстракции суспензию направляют на фильтр-пресс, отжимают
дрожжевой шлам, который используют в дальнейшем для получения
белковых продуктов. Фильтрат направляют на извлечение полинуклеотидов. Выделить БНК наиболее просто осаждением в изоэлектрической точке (ИЭТ) нуклеиновых кислот (1,8–2,0). Однако концентрация нуклеиновых кислот в растворе относительно невелика
(8–10 г/л), а степень их осаждения в ИЭТ зависит от начальной концентрации. Для повышения выхода нуклеиновых кислот бесклеточный фильтрат подвергают ультрафильтрованию. Раствор высокомолекулярных фракций концентрируют в несколько раз и очищают
от низкомолекулярных продуктов, отходящих с пермеатом, который
содержит пептиды, аминокислоты, витамины. Обычно его упаривают
до содержания сухих веществ 20 % и высушивают распылением в токе горячего воздуха. В результате получают готовый продукт –
дрожжевой экстракт очищенный, который может быть использован
в бактериологии как азотсодержащая основа питательных сред [5].
Из концентрированного ультрафильтрата проводят изоэлектрическое осаждение нуклеопротеидов. Для этого раствор сначала охлаждают до 4–6 °С, добавляют соляную или фосфорную кислоту
до значения показателя pH среды 1,0–2,0. Нуклеиновые кислоты
с выходом не ниже 80 % переходят в осадок. Осадок нуклеопротеидов отфильтровывают и направляют на стадию получения очищенной технической РНК.
Для очистки нуклеиновых кислот от белков обычно используют
протеазы, не обладающие заметной РНК-азной активностью. В качестве таковых применяются коммерческие препараты щелочной или
нейтральной протеазы микробного происхождения или панкреатин.
Для этого осадок нуклеопротеидов растворяют в воде до 7,5 %-й концентрации при температуре 40–42 °С. После этого добавляют в необходимом количестве фермент. Гидролиз ведут 4 ч, после чего инакти-
51
вируют протеазу путем нагрева суспензии до 80–90 °С. Раствор
фильтруют и РНК осаждают из раствора добавлением одного объема
кислого этанола на один объем раствора. Осадок технической РНК
отделяют фильтрованием, промывают этанолом и высушивают. Готовый продукт должен содержать не менее 80 % основного вещества.
Очистку нуклеопротеидов от белка можно проводить, используя
ортофосфаты аммония, являющиеся макроэлементами питания
при биосинтезе кормовых дрожжей. Известно, что поли- и ортофосфаты способны образовывать малорастворимые комплексы с белками
по обменной реакции с нуклеопротеидами. Образующиеся при этом
фосфаты белков могут быть легко отделены фильтрованием и в дальнейшем утилизированы на стадии получения кормовой биомассы.
Дрожжевая РНК применяется в медицине при производстве фармакопейного препарата – нуклеината натрия как иммуномодулятора
широкого спектра действия или панкреатического гидролизата РНК,
являющегося субстанцией для производства инъекционного препарата, широко используемого в лечении заболеваний глаз. Также РНК
рассматривают как полупродукт для получения пищевкусовых добавок и лекарственных средств нуклеотидной природы. Используемые
для этого технологии основываются на химическом или энзиматическом гидролизе полирибонуклеотидов [5].
Для гидролиза полирибонуклеотидов используют химические
объекты, индивидуальные энзимы, в том числе иммобилизованные,
и собственные РНК-азы клеток промышленных микроорганизмов.
В качестве пищевкусовой добавки нуклеотидной природы Япония
монопольно производит 5’-инозинмонофосфат и 5’-гуанозинмонофосфат, которые в смеси 2:1 частично заменяют широко распространенный глутамат натрия. Германская фирма «Хехст-Удэ» осуществляет комплексную переработку биомассы метанокисляющих бактерий с получением пищевкусовой добавки на основе продуктов гидролиза микробной РНК.
Кроме мононуклеотидов, роль пищевкусовой добавки могут вы-
полнять и нуклеозиды РНК. Однако они чаще используются как полупродукты для синтеза лекарственных средств нуклеотидной природы.
52
Более глубокий гидролиз полирибонуклеотидов приводит к образованию четырех нуклеозидов, входящих в состав РНК: аденозина,
гуанозина, цитидина, уридина. Нуклеозиды сами по себе редко
используются в медицине. Существенно большее значение имеют их
производные.
Аденозин и гуанозин являются исходными веществами для получения ряда важных противовирусных препаратов. Наиболее известным из производных аденозина является аденин-арабинозид. Он находит широкое применение за рубежом при лечении инфекций, вызванных вирусом типа герпеса. Поскольку сам аденозин весьма токсичен, то в медицине применяются производные аденозина
(2-хлор-, 2-бром-, 2-фтор-, 2-метилтио-, 2-изобутиладенозины). Эти
вещества ингибируют агрегацию тромбоцитов, т. е. задерживают
свертывание крови и препятствуют образованию тромбов в кровеносной системе. Их можно применять также в качестве консерванта
массы тромбоцитов при хранении. Производные аденозина используются и при лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Некоторые
производные аденозина применяются в качестве антисклеротических
веществ, поскольку способны понижать содержание липопротеинов,
холестерина и свободных жирных кислот в крови. Гуанозин может
быть использован в комплексной терапии злокачественных опухолей.
Уридин применяется как безвредный стимулятор физических сил
организма при напряженной работе или после длительных болезней
и т. д. Оказывается эффективным при лечении различных заболеваний печени, сосудов головного мозга, эпилепсии. На его основе получают 5-бромуридин – эффективное средство лечения заболеваний
глаз, вызванных вирусом герпеса. Цитидин находит применение в
медицине только в виде соответствующих производных: цитозинарабинозида (цитарабин), циклоцитидина и цитидинфосфатхолина.
Цитозинарабинозид используется в лечении лейкемии всех видов, а в небольших дозах – при вирусных инфекциях, вызванных вирусом герпеса. Цитидинфосфатхолин находит применение при нарушениях мозговых процессов, вызванных травмой головы и хирургическим вмешательством.
53
Существует несколько способов гидролиза РНК до нуклеозидов
с применением различных химических агентов. Обработка растворов
РНК гидроксидами натрия и аммония при температуре 140–180 °С
и pH среды 9,5 в течение 5 ч обеспечивает полный гидролиз фосфодиэфирных и монодиэфирных связей полирибонуклеотидов с образованием свободных нуклеозидов. В промышленности гидролиз РНК проводят при 120–140 °С, pH 4–6 в течение 5–20 ч в 8 М растворе формиата
или ацетата аммония. Применение для гидролиза гидроксидов кальция
или свинца, эффективно превращающих полирибонуклеотиды в нуклеозиды при температуре 110–130 °С, мольном соотношении субстрат:
гидроксид = 1:1,7, pH 9,0 и времени гидролиза 3–5 ч.
Альтернативой химическому гидролизу РНК является ферментативный гидролиз. Как правило, его осуществляют с помощью комплексных ферментных препаратов микробного происхождения, обладающими РНК-азной и фосфатазной активностью.
Процесс гидролиза обычно происходит в два этапа. Сначала
РНК-аза (экзонуклеаза) расщепляет фосфодиэфирные связи РНК
с образованием смеси из четырех рибонуклеозидмонофосфатов, а потом фосфатаза дефосфорилирует мононуклеотиды, превращая их
в соответствующие нуклеозиды. Возможно использование в процессе
и эндонуклеаз, которые превращают макромолекулы РНК в олигонуклеотиды.
В Японии предложено использовать ферментативный препарат,
выделенный экстракцией из клеток гриба Aspergilus оrуzае, который
при температуре 45 °С за 20 ч гидролиза позволяет получать нуклеозиды с выходом 64 %.
В России для тех же целей рекомендуется обрабатывать раствор
РНК культуральной жидкостью после биосинтеза Str. coelicolor, содержащей внеклеточные экзонуклеазу и фосфатазу, при температуре
37–40 °С и pH среды 8,0–9,0 в течение 5–10 ч. Выход нуклеозидов составляет 75 %.
Растворы, содержащие нуклеозиды, подлежат последующей переработке, заключающейся в выделении отдельных нуклеозидов, ко-
54
торые основываются на одно- или двухступенчатом ионообменном
разделении нуклеозидов.
Помимо индивидуальных соединений, получаемых на основе
продуктов гидролиза РНК, важное значение имеет препарат – панкреатический гидролизат РНК медицинского назначения, представляющий собой смесь олигонуклеотидов (моно-, ди-, три- и тетра-).
Для получения панкреатического гидролизата РНК ее растворяют
в воде при pH 5,0–5,5 так, чтобы концентрация РНК составляла 120–
150 г/л. Раствор нагревают до 65 °С и вносят ферментный препарат
панкреатической рибонуклеазы так, чтобы соотношение фермент/субстрат составляло: 1:500. Гидролиз ведут при 65 °С в течение
5 ч. После очистки раствора гидролизат осаждают этиловым спиртом,
отфильтровывают и высушивают. Конечный продукт содержит
не менее 75 % олигонуклеотидов.
Получение продуктов белковой природы на основе
обезжиренной и денуклеинизированной микробной биомассы
Полученная на предыдущих этапах обезжиренная или денуклеинизированная биомасса клеток промышленных микроорганизмов
(биошрот) может быть переработана в продукты белковой природы.
К ним относятся белковые концентраты, изоляты и гидролизаты, способные найти применение в пищевой промышленности, парфюмерии
и медицине [5].
Практическое значение имеют не нативные белки, а денатурированные, лучше усваивающиеся организмом человека. В настоящее
время можно говорить о трех основных направлениях получения
и очистки белковых гидролизатов:
1) гипоаллергенные белковые изоляты со степенью гидролиза
5–7 %;
2) белковые гидролизаты со средней степенью гидролиза белка
10–30 %;
3) белковые гидролизаты с высокой степенью гидролиза белка
(свыше 50 %), используемые в качестве пищевых добавок и компонентов искусственных соков и напитков.
55
Помимо перечисленных выше направлений, в зависимости
от степени очистки, белковые гидролизаты со средней и высокой степенью гидролиза нашли широкое применение в косметологии для получения различных шампуней, лаков для волос и других косметических средств, в комбикормовой и в микробиологической промышленности для создания многочисленных питательных и диагностических сред [5].
С точки зрения биологической ценности клетки промышленных
микроорганизмов характеризуются высоким содержанием лизина
(3,7 %), лейцина (3,6 %), изолейцина (2,9 %), аспарагиновой и глутаминовой кислот (в сумме 11 %), а по содержанию незаменимых аминокислот микробный белок может быть приравнен к белку куриного
яйца. Однако типичным для него является невысокое содержание серосодержащих аминокислот – метионина и цистеина, что требует
обогащения белковых продуктов этими аминокислотами. В качестве
источника цистеина для обогащения микробного белка можно рассматривать гидролизаты кератинсодержащего сырья.
Исторически первым способом получения продуктов белковой
природы был автолиз, т. е. разрушение клеток дрожжей под действием собственных гидролитических ферментов.
Автолиз биомассы обычно проводят при температуре 48–50 °С
в течение 24 ч в присутствии индукторов автолиза, например толуола,
этилового спирта.
Наибольшее практическое применение нашел получаемый на основе дрожжевого автолизата препарат церевизамин. Было установлено, что по своей биологической активности он не уступает полиамину
– препарату, полученному на основе кристаллических аминокислот,
и может быть использован для различных видов лечебного питания,
включая и парентеральное.
Однако автолиз дрожжевой биомассы, во-первых, может быть проведен только с живыми, физиологически активными клетками, а, вовторых, он сопровождается извлечением в автолизат продуктов гидролиза других биополимеров клетки, что существенно усложняет процесс
получения очищенных смесей аминокислот и низших пептидов [5].
56
Традиционный режим такого автолиза предусматривает глубокий
гидролиз белковых веществ при температуре 50–60 °С в течение 48 ч,
при значении pH, близком к нейтральному, с использованием в качестве мембранотропного агента толуола (1,5–2,0 % от массы дрожжей). Образующаяся гетерогенная смесь гидролизованных биополимеров представляет собой окрашенную в темно-коричневый цвет
суспензию, из которой с большим трудом удается отделить твердую
фазу, а полученный супернатант подвергается глубокой очистке
от пигментов и продуктов деструкции биополимеров небелковой
природы. При этом в готовом продукте доля низших пептидов
не должнапревышать 30 %. Необходимое качество готового продукта
достигалось с использованием многоступенчатого ионного обмена
с применением сильноосновного анионита для отделения пигментов,высокоэффективного сепарационного оборудования, сильнокис-
лотного катионита дли выделениясмеси аминокислот слабоосновного
анионита для ее обессоливания. Для такой технологии типично образо-
вание большого количества сточных вод, что в итоге не позволило ее
реализовать в условиях крупного промышленного производства. Помимо медицинского назначения очищенная смесь аминокислот может
найти применение и вбактериологии как азотосодержащая основа
для приготовления питательных сред и в пищевой промышленности.
Новые технологии предусматривают наряду с высокоочищенной
смесью аминокислот получение и других продуктов. Разработана
технология переработки биомассы пекарскихдрожжей рода
Saccharomyces cerevisiae с получением препарата очищенной смеси
аминокислот,высокомолекулярной фракции дрожжевой РНК и кормового белкового продукта на основе негидролизованного белка
и полисахаридов клеток дрожжей.
Наиболее часто для получения белковых гидролизатов используют кислотный и ферментативный гидролиз. Щелочной гидролиз белков используется реже из-за значительной рацемизации и разрушения
аминокислот ипептидов в щелочных растворах с высоким значением
57
pH среды. Ферментативный способ гидролиза белка является технологически более простым по сравнению с кислотным. Ферментативный гидролиз проводят обычно при 30–50 °С. При таких температурах не происходит разрушения и рацемизации аминокислот и вита-
минов, однако образуетсясложная смесь продуктов гидролиза с различной молекулярной массой. Соотношение продуктовзависит
от типа применяемого фермента и условий гидролиза. При фермента-
тивном гидролизе исчезает необходимость нейтрализации кислот
и щелочей и удаления большого количества образующихся при этом
солей. Посколькулюбой вариант ферментативного гидролиза белковых веществ приводит к образованию сложнойсмеси продуктов,
в том числе и с низким выходом низкомолекулярных фракций (до 10–
15 %), то химический гидролиз предпочтителен, если целью производства являются высокомолекулярные белковые соединения [5].
Теоретически с помощью химического гидролиза можно получать фрагменты интактных белков практически любой молекулярной
массы вплоть до свободных аминокислот. Однако ему присущи свои
недостатки:
1) в качестве химических агентов чаще всего используют мине-
ральные кислоты (соляную, серную, ортофосфорную), что сопряжено
с коррозией основного оборудования; с точки зрения последней проще было бы использовать минеральные щелочи. Однако их применение приводит к образованию токсичных и малоактивных энантиомеров (D-форм) в составе белковых молекул и деструкции ряда важных
аминокислот;
2) в любом случае независимо от вида гидролизующего агента
триптофан практически полностью разрушается;
3) если при ферментативном гидролизе норма расхода титрующе-
го агента (гидроксида натрия или аммония) невысока, то при кислотном гидролизе расходы минеральной кислоты и гидроксидов на ее
нейтрализацию значительны.
Для применения в составе пищевых продуктов и продукции
для медицины разрешено использовать выращенные на мелассе
58
дрожжи видов Saccharomyces serevisiae, Candida lipolitica на этаноле
и некоторые виды метанолокисляющих бактерий. В товарном продукте должно содержаться не менее 80 % белковых веществ, 1–2 %
компонентов нуклеиновых кислот, 1 % природных липидов и до 5 %
углеводов и микроколичества солей тяжелых и токсичных металлов.
При этом предусмотрено, что в чистом виде белковые соединения
в пищу непосредственно не используют, а только применяют в виде
добавок для ликвидации дисбаланса по белку.
Кислотный гидролиз сохраняет свое значение в технологии многотоннажного производства белковых веществ, где его недостатки удается свести к минимуму. Фактически его используют только при получении белковых изолятов, где роль гидролизующего агента практически
сводится к выделению из клетки микробных белков, т. е. к их экстракции. При этом степень деструкции связей интактных белков не превышает 5–15 %, что достигается обработкой микробной биомассы разбавленными растворами соляной или ортофосфорной кислоты (pH 1,5–1,7)
при температуре 140–160 °С в течение 1–5 мин. Для повышения качества получаемых кислотных экстрактов желательно, чтобы из клеток
микроорганизмов на предварительных стадиях были удалены липиды
и в обязательном порядке нуклеиновые кислоты. Это упрощает последующую переработку белковых экстрактов [5].
Технология получения белковых изолятов
Белоксодержащие экстракты клеток промышленных микроорганизмов представлены двумя высокомолекулярными фракциями: так
называемой «глобулиновой» и водорастворимой альбуминовой, что
позволяет в дальнейшем получить два вида белковых изолятов.
Основная часть экстрагируемых белков на 75 % представлена более высокомолекулярными соединениями первой фракции с молекулярными массами от 20 до 100 кДа. Доля альбуминовой фракции составляет не более 25 %. Молекулярные массы входящих в ее состав
белков не превышают 20 кДа.
59
Изолят «глобулиновой» фракции характеризуется ограниченной
растворимостью белковых соединений при физиологическом значении pH среды; хорошо растворим в солевых растворах и сильнокислых и щелочных значениях pH. Имеет изоэлектрическую точку в интервале значений pH 4,2–4,7, где белковые молекулы агрегируют
с образованием осадка.
Изолят альбуминовой фракции, наоборот, практически неограниченно растворим в воде при любых значениях pH среды.
Обезжиренная и денукленизированная биомасса микробных клеток разбавляется водой до 10 % по сухой массе, после чего в полученную суспензию добавляют соляную или ортофосфорную кислоты
до pH 1,5–1,7 и при интенсивном перемешивании нагревают острым
паром до 140–160 °С. При такой температуре суспензию выдерживают 1–3 мин и затем охлаждают. Сепарацией отделяют экстракт белковых веществ от клеточных стенок и полисахаридов (клеточный
дебрис). Выход белковых веществ составляет 50–55 %. На 75 % они
представлены высокомолекулярной фракцией с массой выше 15 кДа.
Для осаждения «глобулиновой» фракции в изоэлектрической
точке экстракт охлаждают до температуры 8–12 °С и добавляют
40 %-й раствор гидроксида натрия до достижения значения pH среды 4,2–4,7. Образующуюся «глобулиновую» суспензию выдерживают на холоде 4–6 ч, достигая степени осаждения белковых веществ 85 %. Полученный осадок «глобулиновой» фракции отделяют фильтрованием и высушивают в распылительной сушилке
до остаточной влажности 5–7 %. Фильтрат после отделения «глобулинов», содержащий альбуминовую фракцию и низкомолекулярные
продукты гидролиза белка, концентрируют ультрафильтрацией, затем освобождают от солей, кислоты и низкомолекулярных продуктов методом диафильтрации. Очищенный продукт высушивают
распылением в токе горячего воздуха.
60
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]