Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основы микробиологического контроля производства пищевых продуктов. Лабораторный практикум. Учебное пособие
.pdf
ных бактерий. Микроорганизмы этой группы имеют форму полиаморфных палочек длиной 1,5-3,0 мкм; они грамотрицательные,
неспорообразующие, подвижные перитрихи; встречаются и неподвижные виды. На плотных питательных средах образуют
плоско-выпуклые колонии с ровным краем, сероватомутноватого цвета, с блестящей поверхностью. Могут сохраняться длительное время в воде и почве.
Бактерии группы кишечных
палочек являются санитарнопоказательными микроорганизмами – индикаторами фекального
загрязнения продуктов, воды, оборудования, рук производственного персонала. Присутствие санитарно-показательных микробов в том или ином объекте указывает на возможное наличие и
патогенных бактерий. Бактерии E. coli считаются условнопатогенными.
Ход работы
Культуральные признаки бактерий. Для каждого представ-
ленного вида бактерий изучают
характер роста на плотной питательной среде МПА в пробирках и отмечают: интенсивность
роста (обильный, умеренный, слабый); особенности штриха
(сплошной с ровным краем, сплошной с волнистым краем, диффузный, перистый); цвет, блеск, поверхность, консистенцию.
Для изучения морфологии бактерий готовят препарат «раз-
давленная капля» и просматривают с объективом 40
х
.
Выявление подвижности бактерий. Многие виды бактерий
способны к самостоятельному движению с помощью жгутиков.
Движение бактериальных клеток лучше всего наблюдать в препарате «висячая капля» или «раздавленная капля», используя молодые бульонные или агаровые культуры в возрасте 12, 18, 24 ч.
Микроскопирование проводят с объективом 40
х
. При наблюдении
под микроскопом в поле зрения хорошо видно активное перемещение клеток в разных направлениях. В отличие от самостоятельного движения клеток, броуновское движение взвешенных
частиц и неподвижных клеток характеризуется беспорядочными
колебаниями на одном месте. При температуре ниже 10
о
С под-
вижность у бактерий прекращается.
31
Простые и сложные методы окраски. Предварительные
операции по подготовке препарата к окрашиванию (приготовление и высушивание мазка) описаны в предыдущей лабораторной
работе.
Фиксацию мазка осуществляют термическим и
химическим способами. Цель фиксации: умертвить клетки микроорганизмов и сделать их безопасными, что особенно важно при
работе с патогенными культурами; плотно прикрепить клетки
стеклу, в результате чего они не смываются при последующих
операциях; улучшить окрашивание, поскольку мертвые клетки
становятся более проницаемыми для красителей.
Наиболее простым и распространенным способом фиксации является термическая обработка. Для этого препарат мазком
вверх 3 – 5 раз проносят через наиболее горячую часть пламени
горелки, пока не возникнет ощущение легкого жжения, если
ложить его к кисти руки. Недостаточно хорошо зафиксированный
мазок смывается со стекла при последующей обработке, а длительная термическая фиксация может изменить структуру микробных клеток и их форму.
Окрашивание мазка можно осуществить разными способами, которые делятся на простые, сложные и дифференциальные. При простой окраске чаще используют
тель и прокрашивают всю клетку. Это дает возможность четко
определить формы и размеры клеток. Сложное окрашивание предусматривает применение двух или нескольких красителей, например диагностическое определение отношения бактерий к окраске по Граму. Дифференциальное окрашивание основано на
индивидуальном отношении биологических структур клетки к
различным красителям (окраска спор, метахроматина
капсул и др.).
При простом окрашивании препарата на охлажденный зафиксированный мазок наносят пипеткой несколько капель раствора красителя. Длительность окрашивания различна: для водного фуксина – 1-2 мин, метиленового синего – 3-5 мин. После
окрашивания мазка краску смывают струей воды из промывалки
до тех пор, пока стекающая вода станет почти неокрашенной. Затем
препарат высушивают на воздухе или при помощи полоски
32
один краси-
при-
к
,
фильтровальной бумаги, которую осторожно прикладывют к
стеклу. Микроскопируют окрашенный препарат в иммерсионной
системе микроскопа.
Окраска по Граму имеет большое практическое
значение для изучения бактерий и их дифференциации. Способность бактерий окрашиваться по Граму связана с молекулярной
организацией и химическим составом клеточной стенки и является важным диагностическим признаком.
По способности окрашиваться
красителями триметилфенолового ряда бактерии делятся на грамположительные и грамотрицательные. Первые удерживают комплекс генцианового фиолетового с йодом при обработке спиртом и поэтому окрашиваются в фиолетовый цвет.
Грамотрицательные бактерии обесцвечиваются спиртом и
при обработке фуксином приобретают розовый цвет.
Как правило, по Граму окрашиваются молодые клетки, ча-
ще суточной
культуры. С прекращением активного роста теряется способность к окрашиванию. Метод окраски состоит в следующем.
На одном обезжиренном стекле делают мазки разных микроорганизмов (например, Bacillus subtilis и Escherichia coli). Препарат высушивают и фиксируют на пламени горелки. Окрашивают 1-2 мин карболовым генцианвиолетом, затем краситель сливают и наносят раствор Люголя на
1-2 мин до почернения мазка.
Сливают раствор Люголя и обрабатывают мазок 30 с раствором с
объемной долей этилового спирта 96 %, после чего мазок промывают водой и дополнительно окрашивают фуксином. Затеи препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют при
увеличении 90
х
с иммерсией.
Выявление спор. В окрашенных препаратах спорообразующих бактерий легко обнаруживаются споры в виде светлых образований круглой или овальной формы внутри клеток (споры не
окрашиваются обычными красителями, т.к. их наружная оболочка малопроницаема).
Обнаружение и окрашивание капсул. Некоторые бактерии,
особенно при росте на богатых углеводами и бедных
азотом сре-
дах, образуют слизистые капсулы, которые которые не видны при
33
микроскопировании живых клеток. Капсулы у разных бактерий
отличаются размерами и химическим составом, слабо воспринимают краску и легко деформируются при окрашивании.
Для приготовления мазка используют культуру Leuconostoc
mesenteroides, характеристика которого представлена (см. табл. 1,
(лабор. работа № 5). Приготовленный мазок фиксируют в смеси
спирт-эфир в соотношении 1:1 в течение 5-10 мин.
Мазок окрашивают 1-3 мин
сафранина 2-3 %. Раствор сафранина готовят перед его применением путем растворения краски в горячей дистиллированной воде с последующим фильтрованием. После окрашивания препарат
микроскопируют с иммерсией. Микроскопическая картина: капсулы бледно-желтые, бактерии коричневые.
Оформление результатов
При оформлении работы необходимо зарисовать микроскопические препараты всех изучаемых микроорганизмов
дом с рисунками дать описание их культуральных и морфологических признаков.
Контрольные вопросы и задания
1. Какие основные формы бактерий вы знаете?
2. Какие сочетания (по взаимному расположению клеток)
наблюдаются у шаровидных и палочковидных бактерий, как они
называются?
3. Как называются спорообразующие бактерии и как обнаружить наличие спор
значение спор.
4. Укажите морфологические и культуральные признаки
микрококков.
5. Дайте характеристику бактериям группы кишечных палочек.
6. Как обнаружить подвижность бактерий?
7. Какова техника простой окраски препаратов и окраски по
Граму? Растворы каких красок при этом используют?
34
в бактериальных клетках? Биологическое
раствором с массовой долей
и ря-
Лабораторная работа № 5
Физиологические группы микроорганизмов
Цели работы:
1. Изучить особенности роста на питательных средах микроорганизмов различных физиологических групп.
2. Определить морфологические признаки маслянокислых,
уксуснокислых и молочнокислых бактерий путем микроскопирования.
Материалы и оборудование: культуры молочнокислых,
маслянокислых и уксуснокислых бактерий, выращенных на жидких питательных средах (обезжиренном молоке, картофельной
среде
с мелом и пивном сусле); микроскопы; все необходимое
для приготовления окрашенных препаратов и микроскопирования.
Теоретические сведения
Принадлежность микробов к определенной физиологической группе обусловлена типом обмена веществ (метаболизмом),
который в свою очередь определяется набором ферментных систем, контролирующих биохимические реакции, протекающие в
клетке. Центральное положение в промежуточном метаболизме
занимает пировиноградная кислота, которая образуется в результате окисления глюкозы в первой, анаэробной стадии, как при
дыхании, так и при брожении. Микроорганизмы заметно различаются между собой по степени использования того или иного
путей образования пировиноградной кислоты, а также способностью образовывать той или иной продукт при дальнейшем ее
окислении: диоксид
вые кислоты – при неполном окислении, специфические продукты – при брожении.
Тип брожения в конечном итоге определяется способностью микроорганизмов вызывать специфическое брожение органических субстратов.
углерода и вода – при дыхании, трикарбоно-
35
Молочнокислые бактерии (МКБ) явля-
ются возбудителями гомоферментативного или гетероферментативного брожения (табл. 1). Объединены в семейство Lactobacil-
laccae. Относятся к микроаэрофилам, не содержат гемопротеинов
(цитохромов и каталазы), грамположительные, неподвижные,
спор не образуют. При гомоферментативном брожении происходят катаболические превращения гексоз с образованием основного конечного продукта – лактата (не менее 90 % всех продуктов
брожения). Гетероферментативные МКБ в качестве конечных
продуктов могут образовывать лактат, ацетат, диоксид углерода,
этанол.
МКБ используются в технологии производства кисломолочных продуктов, творога, сыра, хлеба, при созревании сырой
рыбы и сырокопченых колбас. Молочнокислое брожение лежит в
основе квашения овощей, силосования кормов, получения молочной кислоты. Некоторые виды молочнокислых бактерий
спонтанно развиваются
желательные изменения, например: заболевание крепленых вин,
преждевременное скисание пастеризованного молока, бактериоз
сахарной свеклы, помутнение и быстрое прокисание пива, «кислое брожение» мяса.
Маслянокислые бактерии относятся к роду
Clostridium, который включает большое количество патогенных и
непатогеных видов анаэробных спорообразующих бактерий. Это
грамположительные, подвижные (до спорообразования)
строгие анаэробы, хемоорганогетеротрофы. Споры маслянокислых бактерий чрезвычайно термоустойчивы. Некоторые из них
(Clostridium perfringens) погибают при кипячении только в течение 6 ч. Характеристика отдельных видов маслянокислых бактерий представлена в табл. 2.
в пищевых продуктах, вызывают их не-
палочки,
36
микроорганиз-
Lactococcus
lactis
Lactococcus
cremoris
Lactobacillus
bulgaricus
Lactobacillus
acidophilus
Leuconostoc
mesenteroides
Bifidobacterium
bifidum
37
Название
мов
Гомоферментативные молочнокислые бактерии
Гетероферментативные молочнокислые бактерии
Форма и расположение
Диплококки, короткие
цепочки
Кокки, длинные цепочки 1,2-1,5
Палочки, длинные
и короткие цепочки
Палочки, отдельные
клетки и цепочки
Диплококки, цепочки
из 4-15 клеток
Раздвоенные палочки
клеток
Размеры
клеток,
мкм
0,5х1,0
(2,0-20)х
(1,0-1,5)
(3,0-40)х
(1-1,5)
0,5-1,0
Температура,
оптима-
льная
28-32 10-43
28-32 10-39
40-45 22-53
37-38 20-55
20-30 10-40
36-38 20-50
предель-
ная
о
С
Таблица 1
Предел
кисло-
тообра-
зования,
ºТ
120 Продуцируют
80-100
350
300 Подавляют рост БГКП
50-80 Образуют капсулы
120-130 Строгие анаэробы
Примечание
антибиотик – низин
37
Таблица 2
Форма клеток Размер
Крупная палочка
с закругленными
концами
То же (4-8)х
,, (7-12)х
,, (4-5)х
клеток,
мкм
(4-8)х
(0,4-1,2)
(0,8-1,5)
Cl. saccharobutyricum
(0,5-1,5)
Cl. pasteurianum
(0,1-1,5)
Расположение
спор
Cl .botulinum
Терминальное
или субтерминальное
Сl. perfringens
Центральные
или субтерминальное
Центральное + 35
Центральное + 32
Подвижность
+ 35
- 37
Оптимальная температура
о
С
роста,
По способности ассимилировать различные субстраты (полисахариды, белки, полипептиды) они подразделяются на сахаролитические (Cl. pasteurianum, Cl. butyricum) и пептолитические
клостридии (Cl. botulinum, Cl. sporogenes).
При маслянокислом брожении в разных соотношениях образуются кислоты (масляная, уксусная, молочная), спирты (бутанол, этанол, изопропанол), ацетон и газы (водород, диоксид углерода). Некоторые клостридии в процессе своего развития выделяют
экзотоксины, вызывающие пищевые отравления (Cl. botuli-
num, Cl. perfringens), раневые инфекции – газовую гангрену,
столбняк (Cl. histoliticum, Cl. septicum, Cl. tetani).
Клостридии широко распространены в природе, встречаются в почве, воде, в кишечнике животных, рыб, грызунов. Могут
развиваться в недостаточно простерилизованных мясных продуктах, овощных, рыбных и молочных консервах и т.д.
Уксуснокислые бактерии – это грамотрицательные палочки с перитрихиально
(Acetobacter) или полярно
(Gluconobacter) расположенными жгутиками, обладающие некоторой подвижностью, встречаются и неподвижные. Располагают-
38
ся одиночно или цепочками. Строгие аэробы. Оптимальная температура развития 30
о
С. Размеры клеток (1-3)×(0,3-0,5) мкм.
Осуществляют процесс неполного окисления углеводов или
спиртов с образованием уксусной кислоты. Установлена их способность синтезировать витамин В
. Окисление этанола уксус-
12
нокислыми бактериями лежит в основе производства уксуса.
Встречаются в природных условиях на растениях. Являются составной частью микрофлоры кефирных грибков. Однако при
их развитии в кисломолочных продуктах (простокваше, твороге,
сметане) возникает неприятный запах и привкус уксусной кислоты, консистенция продукта становится слизистой. При нарушении технологических приемов
производства уксуснокислые бак-
терии вызывают скисание вина и пива.
Ход работы
Для приготовления препарата МКБ на предметное стекло в
каплю воды вносят небольшое количество исследуемого продукта (например, кефира или йогурта), тонким слоем распределяют
на поверхности стекла. Далее мазок высушивают, фиксируют в
пламени горелки и окрашивают простым методом. При микро
скопировании препаратов с иммерсионным объективом отмечают
форму и расположение клеток.
Для изучения маслянокислых бактерий, выращенных на
картофельной среде с мелом, готовят препарат «раздавленная капля» и микроскопируют с объективом 40
х
. В препарате отмеча-
ют подвижность, форму клеток, спорообразование.
Для просмотра уксуснокислых бактерий используют прокисшие продукты (вино, пиво и пр.). Для приготовления препарата берут несколько капель субстрата с поверхности (не перемешивая). При микроскопировании препарата «раздавленная капля»
фиксируют форму клеток и подвижность микробов.
Окрашивать мазки по Граму следует по
методике, освоен-
ной на занятии «Бактерии».
39
-
Оформление результатов
Изученные культуры бактерий зарисовывают с указанием
принадлежности к физиологической группе. Рядом с рисунком
помещают описание культуральных и морфологических признаков.
Контрольные вопросы и задания
1. Чем определяется принадлежность микроорганизмов к
той или иной физиологической группе?
2. Охарактеризуйте морфологические и физиологические
признаки молочнокислых бактерий.
3. В каких отраслях промышленности находят
молочнокислые бактерии?
4. Назовите возбудителей маслянокислого брожения и
опишите их характерные признаки.
5. Что обусловливает высокую устойчивость маслянокис-
лых бактерий к неблагоприятным внешним условиям?
6. Возбудителей какого вида брожения вы бы назвали наи-
более опасными? Наиболее полезными? Почему?
7. Назовите области применения уксуснокислых бактерий.
8. Какова негативная роль в пищевой биотехнологии бакте-
рий – возбудителей того или иного вида брожения?
40
применение
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]