Серологическая диагностика инфекционных и инвазионных заболеваний животных и птиц. Учебное пособие

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФГБОУ ВО «ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ ИМПЕРАТОРА ПЕТРА I»

УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ

Серологическая диагностика инфекционных и инвазионных заболеваний животных и птиц

Воронеж

2016

УДК 619:616.9(075) ББК 48.73я7 М 23

Рецензенты:

доцент кафедры ветеринарно-санитарной экспертизы Семёнов С.Н.; заведующая лабораторией токсикологии ВНИВИПФиТ, д. вет. Н. Сашнина Л.Ю.

Манжурина О.А.

М233 Серологическая диагностика инфекционных и инвазионных заболеваний животных и птиц/ О. А. Манжурина, А.М. Скогорева, Б. В. Ромашов: учебное пособие. – Воронеж: ФГБОУ ВО ВГАУ, 2016.

Настоящее учебное пособие по серологической диагностике инфекционных и инвазионных болезней животных и птиц предназначено для слушателей дополнительной профессиональной программы «Серологическая диагностика инфекционных и инвазионных заболеваний животных и птиц». В пособии представлены современные методы серологической диагностики инфекций и инвазий – РТГА, РТГАд, РНГА, РПГА, РН, РДП, РИД, РСК, РИФ, РИА, ИФА, ИБ.

Табл. 9, рис. 3. Библиогр.: 16 назв.

©Манжурина О.А., Ромашов Б. В., Скогорева А.М., 2016

©ФГБОУ ВО ВГАУ, 2016

2

Введение.

Место иммунодиагностики и иммунопрофилактики

вкомплексе диагностических исследований

ипрофилактических мероприятий

Вдиагностике заразных болезней животных используется комплекс методов, включая анализ эпизоотологических показателей и ситуации в регионе, симптомы болезни, патологоанатомические изменения, результаты бактериологических, вирусологических, серологических, аллергических, микологических, микотоксикологических, гематологических, гистологических, электронно-микроскопических исследований, методов генодиагностики и других. Для установления диагноза, дифференциации болезни от сходных с ней, определения наличия у животных патологии, вызванной ассоциациями возбудителей, необходимо проведение в каждом конкретном случае определенного минимума комплексных исследований, регламентируемых действующими наставлениями и инструкциями по диагностике и профилактике.

Предположительный (предварительный) диагноз на болезнь за-

разной этиологии ставят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков и патологоанатомических изменений у павших или вынужденно убитых животных. При анализе эпизоотологических данных учитывают наличие возможных источников возбудителя, факторов его передачи, восприимчивость определенных видов животных к тому или иному возбудителю, возрастные особенности, характер распространения болезни (спорадический случай, эпизоотия, панзоотия), приуроченность к определенной местности (энзоотия), заболеваемость, летальность, динамику болезни и другие показатели.

Значение симптомов болезни, наряду с анализом эпизоотологических данных, характера ее течения (сверхострое, острые, подострое, хроническое, латентное), вызванных возбудителем и продуктами его жизнедеятельности, морфологических изменений в тканях и органах позволяет специалисту своевременно провести не только необходимые дополнительные для окончательного диагноза исследования, но и принять меры по недопущению ее распространения из очага инфекции, предотвращению заражения восприимчивых животных и человека (в случае появления зооантропоноза), проведению лечения больных.

Иммунодиагностика является лишь одним из слагаемых комплекса диагностических исследований, проводимых как при подозрении на заболевание животных, так и с целью профилактики (недопу-

3

щения) болезни среди восприимчивого поголовья. Иммунодиагно-

стика включает в себя серологические и аллергические методы исследования.

Серологические реакции, основанные на специфическом взаимодействии антигена и антител, позволяют выявлять как специфические антитела в сыворотке крови, так и антиген в различных тканях, провести типирование выделенных возбудителей. Серодиагностика используется как метод прижизненной, так и посмертной диагностики, в том числе экспресс - диагностики (РИФ, ККРА, ИФА).

Окончательный диагноз на болезнь заразной этиологии ставят на основании результатов выделения конкретного возбудителя или обнаружения его антигенов и (или) генома в тканях, а также по наличию в сыворотках крови животного специфических антител в диагностических титрах или выявления сенсибилизированных животных с помощью аллергической пробы. При болезнях, характеризующихся развитием в органах и тканях специфического продуктивного воспаления, окончательный диагноз может быть поставлен и по наличию характерных патоморфологических изменений в тканях и органах животного (туберкулез, сап, лейкоз, болезнь Марека и др.).

Диагностическая ценность методов определяется этиологией самой болезни и конкретной ситуацией, в которой эта болезнь развивается. На основании окончательного диагноза в соответствии с законом РФ №4979-1 от 14. 05. 93 «О ветеринарии» и действующих на его основе инструкций проводятся оздоровительные мероприятия по разработанному ветеринарными специалистами и утвержденному администрацией плану противоэпизоотических мероприятий. Все мероприятия проводятся совместно специалистами ветеринарной, сани- тарно-эпидемиологической и других заинтересованных служб в соответствии с законом РФ №52 от 30. 03. 99 «О санитарноэпидемиологическом благополучии населения». При составлении плана противоэпизоотических мероприятий в случае общих для человека и животных болезней, ветеринарные и медицинские специалисты руководствуются санитарными (СП) и ветеринарными (ВП) правилами СП 3.1.084-96 ВП 13.3.4.1100-96 «Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных».

Иммунодиагностика широко используется в ветеринарной практике не только при постановке предварительного и окончательного диагноза, но и позволяет проводить мониторинг (слежение) эпизоотической ситуации по целому ряду инфекционных болезней на основании результатов плановых исследований животных хозяйства, а также

4

В поддержании стойкого эпизоотического благополучия, недопущении инфекционных болезней, проведении оздоровительных мероприятий в случае их появления, наряду с иммунодиагностическими исследованиями, в современных условиях большое значение имеет иммунопрофилактика – создание специфического иммунитета к конкретному возбудителю путем введения в организм иммунных сывороток (пассивная иммунизация) и вакцин (активная иммунизация).

Иммунодиагностика и иммунопрофилактика являются важными составляющими комплексных противоэпизоотических мероприятий (схема 2), проводимых с учетом эпизоотической ситуации в регионе и непосредственно в хозяйстве, вида, возраста животных, сезонности появления среди них того или иного заболевания.

Таким образом, с помощью серологических методов:

1)определяют уровень материнских антител.

2)составляют схемы вакцинации животных и птиц.

3)оценивают эффективность проведенной вакцинации.

4)определяют состояние иммунной системы животного.

5

1 .Серологические методы исследования

Общие сведения.

В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела. В сыворотке крови инфицированного или иммунного организма антитела находятся в основном в глобулиновой фракции. Антителами называются белковые молекулы, способные к специфическому связыванию с антигенными детерминантами. Большинство антител относятся к гамма-глобулинам. Другое название антител

–иммуноглобулины.

Умлекопитающих существует 5 классов иммуноглобулинов, различающихся по своему строению и некоторым свойствам: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. Иммуноглобулины всех изотипов имеют как секреторную форму, свободно накапливающуюся в жидкостях организма (обычно называемую антителами), так и антигенраспознающую рецепторную форму - мембранный Ig, экспрессирующийся на поверхности В-клеток.

Синдесмохориальный тип плаценты сельскохозяйственных животных не проходим для всех иммуноглобулинов. Поэтому новорожденные животные (телята, ягнята, поросята, жеребята и др.) из благополучных хозяйств по инфекционным болезням (за небольшим исключением) рождаются здоровыми, но без защитных иммуноглобулинов. Они поступают в организм с первыми порциями молозива.

На долю иммуноглобулинов класса IgG приходится 75% от общего количества сывороточных иммуноглобулинов. Важным свой-

ством IgG у плотоядных животных, обезьян является их способность проходить через плаценту. Таким образом, у них материнские антитела попадают в организм новорожденного и защищают его от инфекции в первые месяцы жизни (естественный пассивный иммунитет). К классу IgM относится около 10% общего пула («набора») иммуноглобулинов. Антитела класса IgM появляются раньше (на 3—5-й день болезни), чем антитела класса G (через 5-30 дней) и исчезают через несколько недель. Поэтому их обнаружение свидетельствует о только что перенесенной инфекции, в то время как наличие IgG в диагностическом титре и выше свидетельствует о давнем заражении. Антитела класса IgM выявляют методом иммунофлюоресценции или с помощью иммуноферментного анализа. Если выявление антител класса IgM свидетельствует о недавно перенесенной инфекции, то антитела класса IgG сохраняются в течение нескольких лет, а иногда и пожизненно. Антитела класса IgА составляют 15-20% от общего содержания иммуноглобулинов.

6

IgD – в основном находятся на мембране В-лимфоцитов. Концентрация IgЕ в сыворотке крови чрезвычайно низкая. Молекулы IgЕ в основном фиксированы на поверхности тучных клеток и базофилов и связаны с аллергическими реакциями организма.

Таким образом, обязательными компонентами любой серологической реакции являются антиген и антитело. Если для обнаружения результата их взаимодействия между собой - молекулярного комплекса антиген + антитело не требуется дополнительных компонентов и оборудования, они называются прямыми (двухкомпонентными) - пассивная гемагглютинация, преципитация и др. В том случае, когда в реакцию вводится дополнительное вещество (метка для комплекса антиген + антитело), то она является косвенной (трёхкомпонентной). Примерами служат реакция нейтрализации вирусной нуклеиновой кислоты, реакция торможения гемагглютинации, иммунофлюоресцентные и иммуноферментные методы, основанные соответственно на обработке антител (антигенов) флюорохромами или ферментами. Из нескольких «простых» складываются сложные серологические реакции: реакция связывания комплемента и др.

Выбор серологической реакции определяется тем, какая из них наиболее пригодна для работы с данным вирусом, а также возможностями лаборатории и квалификацией персонала. Проще всего задача решается, если вирус, к которому ищут в сыворотках антитела, обладает гемагглютинирующими свойствами. В этом случае поиск и титрование антител имеют смысл проводить в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) как наиболее простой по технике и быстро дающей ответ.

Серологические реакции различаются по способности выявлять отдельные классы антител.

Например, реакции связывания комплемента и гемолиза, которые требуют участия комплемента, не выявляют антитела, не присоединяющие комплемент, например IgA и IgE-антитела.

В реакции нейтрализации вирусов участвуют лишь антитела, направленные против антигенных детерминант (активных зон, молекулярных окончаний) поверхности вириона, связанных с патогенностью. Скорость реакций, чувствительность и специфичность их при выявлении различных антител существенно варьируют.

Биофабрики выпускают антигены и иммунные сыворотки (антитела) известной специфической направленности (диагностические). При помощи таких сывороток в серологических реакциях можно идентифицировать неизвестный микроорганизм или, применяя из-

7

вестный антиген, обнаружить в организме антитела, синтезированные в ответ на внедрение возбудителя, и таким образом поставить диагноз (серологическая диагностика).

Области применения серологических реакций.

Серологические реакции применяют в двух направлениях. Первое направление предусматривает обнаружение с диагно-

стической целью антител в сыворотке крови обследуемого животного. В этом случае из двух компонентов реакции (антитела, антиген) неизвестным является сыворотка крови (антитела). Поэтому такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными анти-

генами.

Положительный результат свидетельствует о наличии в крови антител, гомологичных применяемому антигену; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых.

Однократно проведенное исследование лишь в редких случаях позволяет диагностировать вирусную болезнь. Высокий титр антител против достаточно редко встречающегося возбудителя болезни при наличии типичной клинической картины или необычный титр антител к вирусному антигену специфического типа дают основание лишь предположить наличие острой инфекции.

Достоверные результаты получают при ретроспективной диагностике «парных» сывороток крови больных, взятых в первые дни болезни и через разные промежутки времени от начала заболевания (чаще 14-28 дней). В этом случае удается наблюдать динамику нарастания антител. При вирусных болезнях лишь четырехкратное и большее повышение титра антител во второй сыворотке имеет диагностическое значение.

Кроме того, определение антител раскрывает и другие возможности изучения болезней животных. Так, с их помощью можно определять стадию заболевания, а при анализе популяций вирусов в решении вопросов общей вирусологии — изменчивость вирусных белков.

Уровень антител определяют при постановке любой серологической реакции с разведениями сыворотки и антигена. Последнее

разведение, при котором еще получается отчетливый положительный результат (как правило, на два креста), называется титром сыворотки.

При проведении серологических исследований учитывают следующие особенности:

1.Титры антител в крови постоянно меняются.

2.Выводы на основе анализа титров можно делать только в том

8

случае, если известно, в каком направлении меняются титры.

3. Изменение титров антител определяют путем сравнения двух партий образцов сыворотки, взятых с интервалом 3….4 нед. (при гриппе птиц - 3-5 дней). Подъем титров свидетельствует о недавнем заражении, падение – об его отсутствии.

Второе направление включает установление родовой, видовой

итиповой принадлежности вируса. В этом случае неизвестным компонентом в реакции является антиген. В качестве антигена применяют гомогенаты из органов животных, зараженных определенными вирусами, аллантоисную, амниотическую жидкость, суспензии хори- он-аллантоисных оболочек и желточных мешков куриных эмбрионов, жидкую фракцию и клетки (экстракт тканевых культур).

Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками. Иммунные сыворотки получают путем длительной иммунизации животных (кролики, морские свинки, крысы, лошади, ослы, бараны и др.) соответствующими антигенами. Иммунные сыворотки должны обладать высоким уровнем антител и специфичностью. Сыворотка может быть специфичной в пределах семейства, рода, вида и типа вируса. Ее специфичность обусловлена тем, что она реагирует только с гомологичными антигенами

ине реагирует с гетерологичными.

Для серологического исследования кровь берут до кормления животного (во избежание мутности сыворотки) из доступной вены (яремной, локтевой, хвостовой, подкрыльцовой) с соблюдением правил асептики. Кровь собирают в количестве 5-6 мл в чистые и сухие стеклянные пробирки без антикоагулянтов или консервантов. Получают сыворотку, выдерживая кровь в тепле от 30-60 мин. Образовавшийся кровяной сгусток отделяют от стенок пробирки спицей или стеклянной палочкой, после чего оставляют на 18-20 часов в холодном месте (4…10˚С). Отстоявшуюся сыворотку сливают в другую пробирку. Сыворотка может оставаться на сгустке не более 48 ч после взятия крови. Чистая сыворотка (без примеси эритроцитов) может храниться в холодильнике до 1 мес. При необходимости сохранить сыворотку до 2-3 мес ее необходимо заморозить при температуре от - 20˚ до -70˚С и хранить, избегая оттаивания.

При взятии крови у мелких животных (например, у норок на алеутскую болезнь - плазмоцитоз) ее набирают градуированной пипеткой в количестве 0,1-0,2 мл и вносят в пробирку, куда предварительно было налито 0,9 - 1,8 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия (лучше с содержанием 0,25% цитрата натрия), что со-

9

ответствует разведению сыворотки 1:10. Для осаждения форменных элементов полученную взвесь центрифугируют или оставляют в холодном месте до утра. Отстоявшуюся сыворотку переносят в пробирку и делают из нее последующие разведения.

В условиях экспедиционной работы при массовых профилактических взятиях крови у животных, когда нет возможности поставить серологические реакции на месте, можно прибегнуть к методу «сухой капли». На сложенную вдвое фильтровальную бумагу наносят 0,1 – 0,5 мл сыворотки без примеси эритроцитов. Предварительно на бумаге надписывают данные о животном, дату взятия и количество сыворотки. Сыворотку высушивают при комнатной температуре. Бумагу с высохшей сывороткой складывают в виде пакетика для порошка, который вкладывают в конверт. В лаборатории бумагу нарезают ножницами и опускают в пробирку, куда добавляют изотонический раствор хлорида натрия до разведения 1: 50. Из этого исходного разведения делают последующие, и в дальнейшем постановка реакции ничем не отличается от обычной.

Недостаток метода серологической диагностики – его ретроспективность, так как к моментупостановки диагноза животное, от которого получены парные сыворотки, уже или выздоровело, или пало. Однако поставленный серологическими методами диагноз дает уверенные представления о болезни и имеет важное значение для мероприятий по профилактике и ликвидации вспышки вирусной болезни.

Взятие крови для серологического исследования

Улошадей, крупного рогатого скота, овец и коз кровь берут из яремной вены в верхней трети шеи.

Иглы используют одноразовые или многоразовые, перед взятием крови от каждого животного обязательно стерилизуют кипячением. Шерсть на месте взятия крови тщательно выстригают, и кожу дезинфицируют спиртом: или 3%-ным раствором карболовой кислоты. Нужно следить, чтобы кровь стекала по стенке в пробирку струей, а не каплями. Кровь, взятая каплями и вспененная, скорее гемолизуется и часто дает неправильные результаты при исследовании. Нельзя допускать, чтобы кровь попадала на землю. Для этого надо пользоваться ёмкостью с дезинфицирующей жидкостью, куда спускают первую порцию крови.

Усвиней кровь берут из уха (иглой или шприцем) или из кончика хвоста. Хвост предварительно обмывают водой с мылом и дезинфицируют спиртом или 3 % -ным раствором карболовой кислоты,

азатем кончик отрезают ножницами. После взятия крови кончик хвоста обрабатывают йодом, перевязывают или прижигают.

10