Серологическая диагностика инфекционных и инвазионных заболеваний животных и птиц. Учебное пособие

Список использованной литературы

1.Ветеринарная лабораторная практика. Т. 1/ [сост. Ф.М. Орлов]

.— Москва : Сельхозиздат, 1963 .— 567 с.

2.Зыкин Л. Ф. Очерки по лабораторной диагностике опасных инфекций / Л.Ф. Зыкин, А.Т. Яковлев .— Саратов : Изд-во Сарат.унта, 1993 .— 112 с/

3.Иммунологические методы исследований/ пер. с англ. Г. А. Банникова, Ю. Ю. Венгерова, Г. Г. Гаузе ; под ред. И. Лефковитса, Б. Перниса, А. Т. Михайлова .— Москва : Мир, 1988 .— 530 с.

4.Лабораторные исследования в ветеринарии: вирусные, риккетсиозные и паразитарные болезни: справочник / под. ред. Е. И. Антонова. – М.: Агропромиздат, 1987 – 240 с.

5.Лурия С. Общая вирусология/ С. Лурия, Дж. Дарнелл .— Москва : Мир, 1970 .— 423 с.

6.Манолов А. Твердофазные радиоиммунные и иммуноферментные методы для количественного экспресс-анализа в микробиологии //ЖМЭИ.- 1985.- № 4. – С. 100-107.

7.Практикум по общей вирусологии : учебное пособие / И. Г. Атабеков [и др.] ; под ред. И. Г. Атабекова .— Москва : Издательство Московского университета, 1981 .— 191 с.

8.Сюрин В.Н. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных /В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина//. - М.: Агропромиздат. - 1986.- 351 с.

9.Соколов М.И. Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях / М. И. Соколов, А.А. Синицкий, П.И. Ремезов. - М.: Медицина, 1972. — 215 с.

10.Справочник по микробиологичсеким и вирусологическим методам исследования /под. ред. М. О. Биргера. – 3-е издание.- М.: Медицина, 1982 – 454 с.

11.Ткачева Г. Радиоиммунохимические методы исследования / Г. Ткачева, И. Ларичева, М. Балабокин. - М.: Медицина, 1983. – 183 с.

12.Топчий М. К. Руководство к практическим занятиям по вирусологии / М. К. Топчий, Н. П. Корнюшенко. – М.: Изд-во Киевского ун-та, 1967.—246 с.

13.Троценко Н. И. Практикум по ветеринарной вирусологии /Н. И. Троценко, Р. В. Белоусова, Э. А. Преображенская. - М.: Агропромиздат, 2000.- 287с.

14.Чард Т. Радиоиммунологические методы / Т. Чард. – М., 1981.- 238 с.

15.Штарке Г. Практическая вирусология / Г. Штарке, под ред. В. Н.Сюрина. - М.: Колос, 1970. - 362 с.

16.Шуляк Б. Ф. Вирусные инфекции собак /Б. Ф. Шуляк. – М.: «Олита». – 2004. – 568 с.

61

Приложения

Приложение1

Получение эритроцитов крови

Дефибринирование крови.

Сбор крови донора в стерильный флакон с двумя слоями стеклянных бус на дне с небольшим количеством физиологического раствора. Количество крови не должно превышать ¼ объема флакона.

Непрерывное встряхивание флакона во время и после завершения взятия крови до полного остывания последней.

Фильтрование крови через стерильную марлю.

Получение суспензии эритроцитов.

1. Антикоагулянтный метод получения эритроцитов.

Смешивание свежее взятой крови с антикоагулянтом в растворе Альсевера. В отличии от применения других антикоагулянтов (гепарина, трилона Б, цитрата натрия и др.) ее можно хранить в холодильнике (40 С) 7-12 дн.

2. Центрифужный метод получения эритроцитов

Отмывание эритроцитов перед постановкой теста 3-4 раза в физиологическом растворе центрифужным методом (5-7 мин при 1000 об/мин).

Определение пригодности полученных эритроцитов для РГА по отсутствию их спонтанной агглютинации (самоагглютинации).

Приготовить суспензию эритроцитов в физрастворе, приняв профильтрованные эритроциты за 100 %.

Инкубация 1-5 % суспензии эритроцитов в термостате (370 С) – 1

час.

Определение пригодности полученных эритроцитов для РГА по отсутствию самоагглютинации.

Хранение эритроцитов проводят в следующих растворах:

1. Раствор Альсевера. Готовят по следующей прописи: декстрозы или глюкозы20,5 г, цитрата натрия - 8,0 г, лимонной кислоты - 0,55 г, хлористого натрия - 4,2 г, дистиллированной воды - до 100 мл; рН раствора 6,1. Раствор автоклавируют при 0,06 атм в течение 10 мин или пропускают через фильтр Миллипор или другие фильтры с размером пор 0,22 мкм, затем смешивают с кровью в соотношении 1:1- 5:1.

2. Раствор цитрата натрия

Готовят растворением в 200 мл дистиллированной воды 9,6 г лимоннокислого и 0,85 г хлористого натрия.

3. Борный консервант

Борный консервант готовят растворением в 100 мл физраствора 6,0 г глюкозы и 4,5 г борной кислоты.

62

Приложение 2 I. Освобождение сыворотки крови от термостабильных ингиби-

торов.

1.Простейшим является метод освобождения сывороток от неспецифических ингибиторов с помощью CO2. С этой целью к одному объему сыворотки добавляют 9 объемов дистиллированной воды. Пропускание углекислоты через цельные или разведенные физиологическим или гипотоническим растворами сыворотки не дает части ингибиторов выпасть в осадок. CO2 пропускают в течение 5...7 мин из аппарата Киппа до интенсивного помутнения сыворотки. Вместо газообразной углекислоты можно использовать кусочки сухого льда размером с горошину, которые вносят в пробирку с небольшим интервалом, чтобы избежать пенообразования; для освобождения от образовавшихся хлопьев мукополисахаридов, содержащих неспецифические ингибиторы, пробирки с сывороткой центрифугируют при 1500-2000 об/мин в течение 10...20 мин, надосадочную жидкость отсасывают и для восстановления физиологической концентрации соли добавляют 8,5 %-ный раствор натрия хлорида (1:10 объема). Сыворотки, обработанные углекислотой, не требуют прогревания, так как они освобождаются от термостабильных и термолабильных ингибиторов одновременно. Обработка сывороток CO2 практически не снижает титр специфических антигемагглютининов.

2.Разрушение ингибиторов фильтратом холерного вибриона. К 1 объему прогретой при 56° С в течение 30 мин сыворотки добавляют 4 объема фильтрата холерного вибриона и смесь инкубируют в течение 18...20 ч при 37° С. После этого сыворотку вновь прогревают 1 ч при 56° С. Обработанная таким образом сыворотка считается разведенной 1:5.

3.Удаление ингибиторов каолином или бентонитом. К 0,2 мл сыворотки крови добавляют 0,8 мл физиологического раствора, прогревают при 56° С в течение 30 мин и добавляют 1 мл 25 %-ной взвеси каолина на физиологическом растворе. Смесь встряхивают и оставляют на 20 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют 10-20 мин при 2000 об/мин. После обработки сыворотка разведена 1:10. Удаление ингибиторов

спомощью каолина можно изменить, обрабатывая сыворотку непосредственно в панелях для микротитрования. Для этого в 1-ый ряд лунок вносят предварительно прогретые исследуемые сыворотки в объеме 0,02 мл, затем добавляют к ним 0,18 мл 12,5 %-ной суспензии каолина. После встряхивания и центрифугирования пластины на специальной центрифуге осуществляют двукратные разведения абсорбированной сыворотки путем переноса петлей из лунки в лунку.

4.Разрушение ингибиторов периодатом калия. Готовят 0,05 М раствор периодата калия на дистиллированной воде. Для этого 1,15 г периодата калия (KJ04) растворяют в 100 мл дистиллированной воды при подогревании в водяной бане (70...80 °С) в течение 2...5 мин до получения про-

63

зрачного раствора. Для разрушения ингибиторов к одному объему неразведенной предварительно прогретой при 56° С в течение 30 мин сыворотки крови добавляют один объем раствора периодата калия. Смесь оставляют при комнатной температуре на 2 ч, затем добавляют два объема 5 %-ного раствора глюкозы для нейтрализации действия периодата калия (сыворотка разведена 1:4).

II. Истощение крови в случае самоагглютинации.

К сыворотке крови в разведении 1:5 добавляют равный объем 50 % взвеси эритроцитов. Смесь встряхивают и оставляют на 30 мин при температуре 400 С, а затем центифугируют при 2000 об/мин 5 мин. Надосадочную жидкость вновь проверяют на спонтанную самоагглютинацию.

64

Приложение 3

Получение компонентов РНГА

Подготовка растворов и исследуемых жидкостей. Физиологический раствор, забуференный физраствор (рН 7,2), разбавитель готовят на дистиллированной воде. Физраствор готовят по общепринятой методике. Для приготовления забуференного физраствора с рН 7,2 к 1 л последнего добавляют 0,49 г КН2Р04 и 1,62 г Na2HP04, стерилизуют кипячением, охлаждают и используют в работе. Этот раствор применяют для отмывания эритроцитов и таннизации их. Разбавитель готовят, добавляя к физраствору 0,3 % фенола и 1 % нормальной лошадиной сыворотки. Его используют для разведения исследуемых сывороток или других жидкостей, а также для хранения эритроцитарного диагностикума. Нормальную лошадиную сыворотку, исследуемые сыворотки и другие жидкости абсорбируют эритроцитами с целью освобождения от неспецифических гемагглютининов. С этой целью к одному объему проверяемой биологической жидкости прибавляют 0,1 объема осадка отмытых эритроцитов, пробирку со смесью встряхивают и выдерживают при 37° С в течение 30 мин, затем центрифугируют, извлекают надосадочную жидкость и используют в работе.

Приготовление сенсибилизированных эритроцитов включает:

а) получение эритроцитов. Для этого используют кровь барана, крыс, человека и др. Кровь, полученную из яремной вены (у крупных животных), подкрыльцовой (у птиц), вены Сафена (у мелких животных) дефибринируют с бусами в течение 20...30 мин и трехкратно отмывают забуференным физраствором. Затем их стабилизируют, подвергают таннизации и сенсибилизации. В настоящее время чаще применяют эритроциты птиц - кур, индеек, уток. Приготовленные из них диагностикумы быстрее оседают, что позволяет сократить сроки исследования без потери чувствительности;

б) стабилизация эритроцитов. Преимущество стабилизированных эритроцитов в том, что они могут быть заготовлены впрок и длительное время храниться в суспензии, не подвергаясь гемолизу. Для стабилизации эритроцитов предложено много методов. Чаще всего используют формальдегид, глутаровый или акриловый альдегиды. Приводим один из методов. Из осадка отмытых эритроцитов готовят 10 %-ную взвесь на забуференном физрастворе рН 7,2. Одновременно готовят 0,2 %-ный раствор акролеина на этом же растворителе. Соединяют их в равных объемах и ставят в водяную баню при 37° С на 30 мин. После стабилизации эритроциты трижды отмывают забуференным физраствором и ресуспендируют в этом же растворе до 10 %-ной концентрации, разливают по пробиркам и хранят при 2...4° С. Срок хранения - 1 год;

в) танизация эритроцитов. Механизм действия танина на эритроциты изучен слабо. Но при этом достигается главное - танизированные эритроциты обладают значительно большей сорбционной емкостью. Фармако-

65

пейный танин должен обладать хорошей растворимостью в воде. Хранят его в прохладном сухом месте в сосуде, обернутом в черную бумагу. Раствор танина готовят непосредственно перед опытом. Для этого берут навеску 0,25 г порошкообразного танина и растворяют в 50 мл забуференного физраствора рН 7,2. Получают разведение 1:200, которое является основным и сохраняется на холоде при 2...4° С в течение месяца. Из основного разведения готовят рабочее (1:20000). К 5 %-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов на забуференном физрастворе добавляют равный объем раствора танина в разведении 1:20000. Смесь выдерживают в водяной бане 20...30 мин при 37° С. В дальнейшем производят отмывание физраствором 2-3 раза и осадок ресуспендируют в физрастворе до 50 %-ной концентрации. Хранят танизированные эритроциты при температуре 2...4° С. Контроль на их самоагглютинацию ставят через 18...20 ч после приготовления. Для этого в лунке панели смешивают каплю полученной 2 %- ной суспензии танизированных эритроцитов и каплю разбавителя. Через два часа эритроциты должны осесть на дно лунки в виде компактной точки. В случае незначительной агглютинации танизированных эритроцитов (+ или ++) суспензию необходимо дополнительно выдержать при 2...4° С в течение 2...3 суток, после чего повторяют контроль. Если эритроциты и в этом случае оседают в виде "зонтика", то их считают непригодными и готовят заново.

г) Сенсибилизация эритроцитов. Для этого используют антисыворотки или антигены. К 0,2 мл 50 %-ной суспензии сенсибилизированных танизированных эритроцитов на физрастворе добавляют 0,2 мл раствора антигена или антител (концентрация по белку 2 мг/мл) и 0,6 мл физраствора. К данной смеси приливают по каплям 1 мл 0,1 %-ного раствора хрома хлорида и оставляют при комнатной температуре не более, чем на 5 мин. Реакцию останавливают прибавлением 20...50 объемов 0,02 М фосфатно-буферного раствора рН 7,2, для приготовления которого берут 50 мл фосфатного буфера и 325 мл дистиллированной воды. Затем трижды отмывают этим же буфером и хранят в рабочей концентрации (2 %-ная взвесь в разбавителе). Для конъюгации можно использовать и другие конъюгирующие агенты (глютаровый альдегид, риванол, ализариновый синий). Полученные таким образом сенсибилизированные эритроциты используют в РНГА.

66

Приложение 4 Приготовление геля для постановки РДП.

Берут 1 весовую часть очищенного агара ("Дифко" и др.) и добавляют к ней 99 весовых частей физиологического раствора (можно использовать забуференные или буферные растворы с рН 7,3 -7,4), Колбочку со смесью ставят в кипящую водяную баню, растворяют агар и добавляют консервант (мертиолят натрия 1:10000). Затем смесь разливают по пробиркам и употребляют по мере надобности. (Используемые для РИД сухие неочищенные агары различных марок подвергают предварительной очистке. Берут одну часть его, заливают 30 частями дистиллированной воды, добавляют 0,5 % хлористого кальция и кипятят до расплавления. Горячий агар-агар фильтруют через двойной слой марли и разливают тонким слоем в стеклянные сосуды с плоским дном. После застывания агаровый гель разрезают на мелкие кусочки (1х1 см), складывают в стеклянную банку, обвязывают сверху марлей и ставят под струю водопроводной воды на трое суток для промывания. Затем воду сливают через марлю. Промытый гель расплавляют в водяной бане, добавляют к нему равное количество 1,6 %-ного раствора NaCI и мертиолят натрия 1:10000. Приготовленный таким образом агаровый гель, разливают по колбочкам и до употребления хранят при температуре 4° С. Рекомендуется хранить агар в больших объемах (по 30-60 мл), так как при повторном разогревании жидкость испаряется, изменяется концентрация агара, нарушаются его физико-химические свойства.)

67

Приложение 5

Приготовление антигенов.

Инфекционный материал освобождают от грубых тканевых частиц, измельчают ножницами и растирают в ступке с кварцевым песком, разбавляют буферным раствором и центрифугируют. Надосадочную жидкость отсасывают и подвергают дальнейшей обработке. Эта обработка преследует следующие цели: максимальное освобождение вируса из клеток, удаление клеточных материалов и разрушение прокомплементарной активности. Вирусные материалы для антигенов берут из органов и тканей естественно или экспериментально зараженных животных с учетом тропизма вирусов и сроков вирусовыделения. Антигены можно получать из зараженных куриных эмбрионов и культуры клеток с учетом стадии репродукции вируса и особенностей его накопления в клетках или вне клеток в питательной среде. Однако, в любом случае в препаратах антигенов относительно много материала клеток хозяина. Такой материал потенциально способен взаимодействовать с антителами. Поэтому всегда необходимо ставить контрольную реакцию с антигеном, полученным из аналогичной незараженной ткани. Таким образом, определяют наличие в препарате антигенов клеток хозяина. Их количество можно уменьшить, очистив препарат с помощью центрифугирования в градиенте плотности, хроматографией на колонке или путем воздействия фторуглеродных соединений или органических растворителей (ацетон, эфир, хлороформ). Некоторые антигены обла-

дают антикомплементарной активностью, т.е. способны сами по себе связывать или разрушать те или иные компоненты комплемента. Удалять материал, обладающий антикомплементарной активностью, рекомендуется с помощью фторуглеродистых соединений или обрабатывая его прогретым комплементом морской свинки.

Приготовление сывороток. Для получения сывороток, содержащих комплементсвязывающие антитела, лабораторных животных подвергают либо иммунизации по определенным схемам, либо заражению инфекционным агентом. Введению активного вируса предшествуют две-три инъекции формалинизированной суспензии. После получения сыворотки титруют (определяют количество антител), а затем лиофилизируют или консервируют. Лиофильно высушенные сыворотки можно хранить в условиях холодильника до 4-х лет. Для консервирования сывороток наиболее удобным и общедоступным средством является фенол. Готовят 5 %-ный раствор фенола на физрастворе и добавляют в сыворотки из расчета 1:9. Добавление проводят по каплям при постоянном перемешивании. Фенолизированные сыворотки фасуют по ампулам и хранят в условиях холодильника в течение года. Все сыворотки, используемые в РСК, перед опытом обязательно инактивируют в течение 30 мин: сыворотки морской свинки и кролика при 56° С, крыс - при 60° С, собак - 65° С, мышей - 60° С, крупного рогатого скота - 56...58° С, лошадей и овец - 58-60° С.

68

Сыворотки, как и антигены, тоже обладают антикомплементарностью, т.е. способностью связывать комплемент в отсутствие антигена и тем самым задерживать гемолиз. Она может быть обусловлена как длительным хранением сывороток, так и свойством, присущим некоторым животных (например, кроликам). Поэтому сыворотки нужно хранить в состоянии глубокой заморозки или лиофильно высушенными. Кроме того, следует тщательно отделять сыворотку от сгустка, не захватывая эритроцитов. Для устранения антикомплементарности их прогревают при температуре на 1- 2° С выше необходимой для инактивации комплемента, или замораживают при минус (20...70)° С с последующим удалением осадка центрифугированием. Хорошие результаты дает обработка сывороток углекислотой (см. РЗГА) или комплементом морской свинки. Для этого к 3-м объемам сыворотки добавляют 1 объем комплемента морской свинки, смесь инкубируют в течение ночи при 4° С, а затем 30 мин при 37° С. После этого сыворотку разбавляют 1:4 или 1:8 буферным раствором и инактивируют при 60° С в течение 30 мин.

Эритроциты. Обычно при постановке реакции применяют эритроциты барана. Их получение описано в теме 1.

Комплемент выпускают биофабрики в лиофилизированном виде. Но его можно получить в любой лаборатории. Для этого у морских свинок из сердца берут кровь, помещают ее в термостат на 30 мин, сгусток отделяют стерильной спицей и выдерживают ночь в холодильнике. Затем сыворотку собирают пастеровской пипеткой и консервируют, добавляя к 10 мл ее 0,2 г борной кислоты и 0,3 г сернокислого натрия. Комплемент сохраняется до 2-х недель в холодильнике в замороженном состоянии. Его титруют каждый раз в день постановки главного опыта.

Гемолизин - сыворотка крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Выпускают гемолизин биофабрики в сухом виде.

Обнаружение и идентификация вируса ящура в РСК. РСК по 100 %-

ному гемолизу применяют для определения типов и вариантов вируса ящура. РСК ставят в различных объемах: если общий объем 1 мл - каждый компонент берут в объеме 0,2 мл; общий объем 0,5 мл - каждый компонент берут в объеме 0,1 мл.

Для приготовления антигена стенки афт от больных животных отмывают от консервирующей жидкости физраствором, высушивают фильтровальной бумагой, взвешивают, измельчают и тщательно растирают в ступке с песком, добавляют двойное по отношению к массе афт количество физраствора. Полученную суспензию экстрагируют при комнатной температуре в течение 2 ч, замораживают до минус 10...200 С) в течение 5...18 ч. После размораживания центрифугируют. Надосадочную жидкость инактивируют 40 мин при 58° С и используют в качестве антигена РСК.

69

Содержание Введение. Место иммунодиагностики и иммунопрофилак-

тики в комплексе диагностических исследований и профилактических мероприятий

1.Серологические методы исследования

2.Титрование вирусов по гемагглютинирующему действию для постановки РТГА и РТГАд

3.Постановка реакции торможения (задержки) гемагглютинации (РТГА, РЗГА) и задержки гемадсорбции (РЗГАд)

4.Самостоятельная работа слушателей

5.Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА, РПГА)

6.Реакции нейтрализации (РН)

7.Реакции, основанные на феномене преципитации. Реакция диффузионной преципитации (РДП), реакция иммунодиффузии (РИД)

8.Реакция связывания комплемента (РСК)

9.Реакции с использованием химических и физических меток

9.1.Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) и ее диагностическое значение

9.2.Радиоиммунный анализ (РИА)

9.3.Иммуноферментный анализ

9.4.Методы иммуноблоттинга (ИБ)

9.5.Твердофазный иммуноферментный анализ

9.6.Метод иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием индикаторных полосок Список использованной литературы Приложения

70