Серологическая диагностика инфекционных и инвазионных заболеваний животных и птиц. Учебное пособие

У птиц кровь берут из вены крыла или из гребешка.

Брать кровь надо по возможности утром, до кормления животных. Для серологического исследования от крупного рогатого скота, лошадей и других крупных животных, овец, свиней кровь берут в количестве 7-10 мл.

Взятую кровь выдерживают около часа при 30-35°С для свертывания, а затем выносят в прохладное помещение для отстаивания. Через 10-12 часов отстоявшуюся сыворотку переливают в другие пробирки. Если сыворотка недостаточно отстоялась или верхний слой сгустка плотно прилегает к стенкам пробирки и отстаивание начинается снизу, то сгусток отделяют от стенок пробирки тонкой предварительно прокаленной и остывшей проволокой.

Сыворотка крови должна быть доставлена в лабораторию в течение первых суток и в исключительных случаях не позднее третьего дня после взятия крови.

При пересылке сыворотки на большое расстояние, особенно летом, её необходимо консервировать 5%-ным раствором карболовой кислоты на физиологическом растворе из расчета на каждые 9 мл сыворотки 1 мл раствора карболовой кислоты или 1-2 капли раствора на 1 мл сыворотки.

Раствор карболовой кислоты необходимо подливать по каплям при постоянном встряхивании пробирки с сывороткой.

Сыворотку или кровь можно консервировать также борной кислоты (в порошке) из расчета 0,05-0,07 г (на кончике скальпеля) на одну пробирку с кровью (сывороткой). Сыворотку можно консервировать также высушиванием.

Для высушивания сыворотку наносят на фильтровальную бумагу размером 5×5 см в количестве 0,4 мл и выдерживают в комнате при рассеянном свете до полного высыхания. После этого на каждой бумаге с высушенной сывороткой делают соответствующие записи простым карандашом и завертывают в пергаментную бумагу (каждую пробу отдельно), а затем упаковывают в конверт и в таком виде отсылают в лабораторию.

В лаборатории каждую пробу сухой сыворотки помещают в пробирку, заливают 2 мл физраствора, помещают в термостат на 6-10 часов или оставляют в комнате на 24 часа и затем исследуют. Сухие сыворотки сохраняют свои антигенные свойства от 40 до 130 дней.

Для серологического исследования в лабораторию можно отправлять и цельную кровь, не отделяя сыворотку, но при условии, что в пути ее не будут встряхивать и она не подвергнется гемолизу.

На каждой пробе сыворотки или крови указывают ее номер или кличку животного или фамилию владельца животного. Пробы на-

11

правляют с описью в двух экземплярах.

Пробирки с сыворотками плотно закрывают стерильными пробками и устанавливают для пересылки в строго вертикальном положении.

Зимой сыворотки упаковывают и пересылают так, чтобы они не замерзали.

Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 суток со дня взятия крови при условии хранения их при 4- 80С.

Сыворотки консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 суток, замороженные сыворотки – в течении 3 суток после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию не подлежат. В случае доставки крови без сыворотки ее нельзя консервировать или замораживать.

Кровь от абортировавших животных должна доставляться дважды- непосредственно сразу после аборта и через 14-21 день с настоящего момента крововзятия.

Для исследования молока на бруцеллез в кольцевой реакции пробу (10-15 мл) цельного свежего молока берут из одного удоя от коровы в стерильную пробирку. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и прочее) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

При направлении молока на исследование в лабораторию каждую пробу консервируют добавлением одной капли 10%-ного формалина на 5-10 мл молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течении 2-3 суток. Перед исследованием его необходимо перемешать для равномерного распределения сливок. При массовом исследовании молока постановку КР следует проводить на ферме в специально отведенном помещении.

Не разрешается исследовать в КР молоко от коров, страдающих маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые 2 недели после родов.

На лептоспироз пробы крови берутся не ранее чем через 5-7 суток после проявления клинических признаков болезни или не ранее чем через 90 суток после вакцинации крупного рогатого скота, для свиней после вакцинации через 60 суток и других видов животных, а также не ранее, чем через 10-12 дней после проведенного лечения.

12

2. ТИТРОВАНИЕВИРУСОВ ПО ГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩЕМУ ДЕЙСТВИЮ ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РТГА И РТГАД

Диагностические реакции РГА и РГАд

В вирусологической практике широко применяются диагностические реакции, основанные на феномене агглютинации. Они основаны на способности вирусов адсорбироваться на поверхности эритроцитов, имеющих к ним специфические рецепторы, вызывая их склеивание. Это реакции гемагглютинации и гемадсорбции. Реакция гемагглютинации (от греч. Наето - кровь и лат. agglutio - склеивать) - реакция склеивания эритроцитов (РГА). Они предназначены исключительно для обнаружения возбудителя.

Рис. 1. Схема реакции гемагглютинации

В 1941 г. Херст, Мак Клиленд и Хейр показали, что вирус гриппа агглютинирует эритроциты кур. Впоследствии было показано, что агглютинацию эритроцитов вызывают очень многие вирусы, относящиеся к большинству известных в настоящее время групп вирусов животных. Было также обнаружено, что некоторые вирусы обладают способностью вызывать адсорбцию эритроцитов на поверхности зараженных ими клеток, растущих в однослойных культурах. Это явление было названо гемадсорбцией. Впервые гемадсорбция была обнаружена в 1957 году Щелоковым и Фогелем. Оказалось, что вызываемые вирусами гемагглютинация и гемадсорбция представляют собой весьма полезные инструменты для изучения вирусов, применяемые в вирусологических исследованиях самого различного рода. Ниже перечислены области, использования этих реакций.

1. Выделение вирусов. Гемагглютинация и гемадсорбция ши-

13

роко используются для выявления миксовирусов как в жидкостях зараженных куриных эмбрионов (гемагглютинация), так и в зараженных клетках культур тканей (гемадсорбция). Некоторые миксовирусы можно выявить только с помощью гемагглютинации либо гемадсорбции. Ряд вирусов этого типа впервые обнаружили именно с помощью данных методов. Гемадсорбцию используют также для обнаружения вирусов, относящихся к другим классификационным группам (например, к семейству вирусов оспы). Кроме того, РГАд выявляется раньше, чем ЦПД в зараженных клетках, она позволяет установить вирусную природу деструктивных изменений клеток.

2.Идентификация вирусов. Гемагглютинация и гемадсорбция (в том случае, если вирус дает эти феномены) - обычно наилучший способ определения серотипа и классификационной принадлежности вируса. В основе наиболее точного метода идентификации вирусов этого типа лежат реакции торможения гемагглютинации или гемадсорбции. Однако для предварительной идентификации и классификации иногда пользуются иными «маркерами» гемагглютинации. К их числу относится избирательная способность вируса агглютинировать эритроциты животных, титр реакции гемагглютинации, а также оптимальное значение рН и оптимальная температура реакции (4˚С или

37˚С).

3.Классификация вирусов. Установлено, что особенности гемагглютинации вирусов служат хорошей основой для разделения их на группы и подгруппы. Например то, что вирусы, вызывающие столь различные заболевания, как грипп и ньюкаслская болезнь, были отнесены к одной классификационной группе, явилось в основном результатом изучения их поведения в реакции гемагглютинации. В качестве классификационных критериев используют тесты на степень перекрестного торможения гемагглютинации, а также «маркеры» гемагглютинации, упомянутые выше.

4.РГА как предварительный этап постановки РТГА с целью обнаружения антител. Из всех реакций, в основе которых лежит гемагглютинирующая способность вирусов, наиболее широкое применение для выявления и титрования противовирусных антител, благо-

даря своей простоте, находит реакция торможения гемагглютина-

ции. Широта спектра специфичности антител, выявляемых с помощью этой методики, сильно варьирует и определяется в основном классификационной принадлежностью вирусов. Например, при заболеваниях, вызываемых вирусами оспы, с помощью этой реакции выявляются группоспецифичные антитела, тогда как при заболеваниях,

14

вызываемых аденовирусами, типоспецифичные. Антитела, образующиеся в организме искусственно иммунизированных животных, судя по реакции торможения гемагглютинации, иногда более специфичны, чем антитела, появляющиеся в организме животных, заразившихся естественным путем. Обычно антитела к гемагглютинирующим вирусам, дающим реакцию РГА, можно титровать с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Однако это не всегда удается, так как в некоторых случаях в сыворотках содержатся неспецифичные ингибиторы гемагглютинации, которые не удается удалить ни одним из известных методов (добавлением сыворотки крови, пропусканием углекислого газа, обработкой каолином) (приложение 1, 2).

5.Концентрирование и очистка вирусов. Некоторые вирусы,

вызывающие агглютинацию эритроцитов, элюируются (покидают) с их поверхности при условиях, существенно отличающихся от условий, при которых происходит максимальная адсорбция. Это свойство часто используют на практике. Так, оно лежит в основе относительно простого метода титрования и очистки вирусных суспензий. Многие вирусы адсорбируются на эритроцитах при 4˚С, а элюируются при 37 ˚С, и наоборот. Вирусную суспензию смешивают с эритроцитами при температуре, оптимальной для адсорбции, затем агглютинат центрифугируют и промывают. В дальнейшем изменяют температуру и вирус элюируется с поверхности эритроцитов. В результате получают суспензию вируса, относительно свободную от сопутствующего материала.

6.Изучение структуры и функции вирионов. Реакция гемагг-

лютинации в сочетании с электронной микроскопией и биохимическими методами исследования является ценным методом изучения структуры и функции вирионов. Например, способностью агглютинировать эритроциты обладают не только сами вирионы аденовирусов и вирусы чумы плотоядных, но также частицы, величина которых значительно меньше, чем величина интактных вирионов.

Диагностическая ценность. Достоинство РГА заключается в том, что она широко используется в вирусологической практике как быстрый, технически простой и надёжный метод для обнаружения гемагглютинирующих вирусов в исследуемом вируссодержащим материале (органах, тканях, фекалиях, культурах клеток, вакцинах и т. д.), а также для титрования вирусных гемагглютининов, в том числе как предварительный опыт перед постановкой РТГА. Основным ее недостатком служит риск получения неспецифических результатов, связанный с наличием гемагглютинирующих свойств у многих мик-

15

роорганизмов (в т. ч. столь распространенных бактериальных контаминантов тканей животных и культур клеток, как микоплазмы), а также у ряда не содержащих вирусы субстратов (сыворотки крови,

слюны). Особенностью РГА является то, что она неспецифиче-

ская, не серологическая реакция, следовательно, вид вируса в ней не определяется.

Агглютинацию эритроцитов вызывают вирусы, содержащие антиген гемагглютинин. Механизм реакции состоит в присоединении вируса к поверхности эритроцитов в результате физико-химического процесса, зависящего от разности зарядов и других сил межмолекулярного притяжения. Эритроциты склеиваются и выпадают в осадок в виде «зонтика».

Агглютинация эритроцитов - явление, состоящее из трех фаз.

В первой фазе происходит адсорбция вируса на эритроцитах. Затем во второй фазе агглютинация эритроцитов с адсорбированным вирусом. Может наступить и третья фаза - элюции вируса от эритроцитов

(рис. 1).

Факторы, влияющие на РГА, многочисленны. Основные из них приводятся ниже.

Штаммы вирусов. (Штамм – генетически однородное по происхождению потомство одной вирусной частицы в пределах данного вида вируса, обладающее специфическими признаками). Гемагглютинирующая активность штаммов вирусов неодинакова. У одних серотипов энтеровирусов все штаммы способны агглютинировать эритроциты, тогда как у других серотипов того же вируса не все штаммы обладают этим свойством. Каждый из гемагглютинирующих вирусов способен агглютинироватъ эритроциты животных только определенных видов и в определенном диапазоне температуры и рН среды, что иногда используется при дифференциальной диагностике. Так, вирус классической чумы птиц агглютинирует эритроциты лошади и кошки, а вирус ньюкаслской болезни их не агглютинирует.

Клетка-хозяин. Известно, что в ряде случаев способность вируса агглютинировать эритроциты зависит от хозяина, в котором он размножался. Этот эффект может не зависеть от титра вируса или образования ингибиторов гемагглютинации, хотя очевидно, что определенную роль могут играть и эти факторы.

К числу других факторов, которые влияют на гемагглютинацию, относятся доза вируса, используемая при заражении животного, куриного эмбриона или культуры клеток, температура, при которой культуру инкубируют, метод заражения и др.

16

Видовая принадлежность эритроцитов, используемых в РГА,

имеет важное значение для хода реакции. Некоторые вирусы способны агглютинировать эритроциты животных многих видов. В то же время известны вирусы, агглютинирующие эритроциты животных только одного какого-нибудь вида. В ряде случаев вирусы вызывают агглютинацию эритроцитов животных только тех видов, которые чувствительны к заражению данным вирусом, или клетки которых можно заразить данным вирусом in vitro. В других случаях такую связь обнаружить не удается. Обычно вирусы, относящиеся к одной классификационной группе, способны агглютинировать эритроциты животных, принадлежащих к одному и тому же виду. В РГА наиболее широко используют эритроциты домашних птиц и млекопитающих.

Возраст донора. Возраст донора, от которого получают эритроциты, в значительной степени влияет на их агглютинацию. Например, вирусы оспы значительно интенсивнее агглютинируют эритроциты взрослых кур, чем только что вылупившихся цыплят, а для многих арбовирусов и вирусов бешенства характерна обратная зависимость.

Индивидуальные особенности доноров. Факторы, определяющие пригодность эритроцитов животного данного вида для РГА - это индивидуальные различия в чувствительности эритроцитов к вирусу, иногда пол животного – донора и др.

Факторы окружающей среды, влияющие на РГА. Сильное влияние на агглютинацию эритроцитов вирусами оказывает температура. Одни вирусы агглютинируют эритроциты лучше всего или только при 4˚С, другие - при 37˚С, третьи - одинаково хорошо при любой температуре, хотя по соображениям удобства РГА обычно ставят при комнатной температуре (от 20 до 25˚С). Следует отметить, что пока еще не было обнаружено ни одного вируса, который агглютинировал бы эритроциты при этих температурах лучше, чем при 4˚С или при 37˚С. Способность вируса агглютинировать эритроциты, в особенности в тех случаях, когда она слаба, как например, у арбови-

русов, зависит также и от концентрации водородных ионов. Так, на-

пример, некоторые арбовирусы разрушаются при значениях рН, соответствующих оптимуму для вызываемой ими гемагглютинации. Вирус необходимо разбавлять раствором, рН которого отвечает условиям его стабильности, а затем доводить рН смеси до значения, оптимального для гемагглютинации, используя соответствующий разбави-

тель. У некоторых вирусов способность агглютинировать эритро-

циты зависит от наличия или отсутствия в среде некоторых ионов, например, Са2+, Nа+, Mg2+. Иногда присутствие вирусных гемагглю-

17

тининов маскируется наличием в системе ингибиторов сложного состава, поступающих из клеток, в которых размножался вирус. Перед постановкой РГА эти ингибиторы удаляют путем прогревания, обработки ацетоном, эфиром, фторуглеродными соединениями, трипсином, рецепторразрушающим ферментом и высокоскоростным центрифугированием. Ингибиторы чаще встречаются в препаратах вирусов, полученных из тканей интактных животных, чем из культур клеток.

Учет и оценка результатов реакции. РГА учитывают визуально по форме образовавшегося осадка эритроцитов – гемагглютината в гемагглютинирующих единицах (ГАЕ).

При резко положительной РГА ("+++") в начальных лунках образуется рыхлый осадок (зонтик) на дне и стенках лунки; "++" - осадок только на дне лунки, по краям хорошо виден «зонтик»; "+" - наличие незначительной агглютинации эритроцитов на дне лунки в виде «пуговки» с ровными краями или четко контурированного кольца с небольшим количеством агглютината; "-" - эритроциты оседают на дне лунки в виде компактного круглого осадка «пуговки» (отрицательная).

Гемагглютинирущий титр вируса - это наибольшее разведение

(наименьшее количество вируса), при котором наблюдается гемагглютинация не менее, чем на "++". Это разведение соответствует одной гемагглютинирующей единице (1 ГАЕ, см. табл.1). В таком же объеме исследуемого (без разведения) материала таких единиц (доз) вируса будет больше во столько раз, во сколько раз пришлось развести материал, чтобы получить 1 ГАЕ. Так, если высшим разведением, еще дающим гемагглютинацию, оцениваемую на "++", будет 1:16 (табл.1), это значит, что в объеме разведения вируса, разведенного в 16 раз, содержится 1 ГАЕ, а в таком же объеме титруемого материала таких единиц будет 16, т.е. титр вируса в данном материале равен 16 ГАЕ. Поскольку суспензию эритроцитов и вируссодержащий материал в разведениях берут в равных объемах, то безразлично, на какой объем будет приходиться 16 ГАЕ, ибо с возрастанием объема одного компонента во столько же раз увеличивается и объем другого. Поэтому соотношение количеств эритроцитов и вирионов в смеси вируссодержащего материала с суспензией эритроцитов при изменении их объемов не изменяется, значит, не изменяется и число ГАЕ.

Гемадсорбция - одна из модификаций РГА включает соединение эритроцитов с поверхностью пораженных вирусом клеток. Сущность реакции заключается в том, что на поверхности клеток, инфи-

18

цированных гемагглютинирующим вирусом, адсорбируются эритроциты, чувствительные к нему. Так, например, на клетках, инфицированных вирусом парагриппа-3, адсорбируются эритроциты морской свинки, вирусом гриппа - эритроциты кур и т.д.

Реакцию гемадсорбции целесообразно ставить с целью обнаружения (до проявления или при слабо выраженном ЦПД) в инфицированной культуре клеток вируса, обладающего гемагглютинирующей способностью (например, в диагностике вируса африканской чумы свиней).

Компонентами реакции служат культура клеток в пробирках в контроле и инфицированная, а также 0,4 %-ная взвесь эритроцитов, приготовленная на физиологическом растворе или растворе Хенкса.

Методика реакции. Из пробирок с культурой клеток, инфицированных и неинфицированных (контроль), удаляют питательную среду (можно без удаления) и вносят 0,2 мл 0,4 %-ной взвеси эритроцитов, способных агглютинироваться предполагаемым вирусом. Затем штатив с пробирками встряхивают и оставляют в наклонном положении полосой вверх, при комнатной температуре или помещают в холодильник, длительность контакта эритроцитов с клетками зависит от температуры инкубации и вида вируса. Так, гемадсорбция с респираторными вирусами при комнатной температуре наступает через

3...5 мин, а при 4˚С - через 30...50 мин.

Учет реакции гемадсорбции проводят при малом увеличении микроскопа после непродолжительного покачивания или вращения пробирки для отделения неадсорбированных эритроцитов от поверхности клеток. При вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксируются на клетках и сохраняются на них после 1-2-кратного промывания. На клетках, пораженных вирусом, эритроциты адсорбируются в виде островков или диффузно (островковый и диффузный тип адсорбции). При отрицательной реакции адсорбция эритроцитов на культуре клеток не наступает, и они свободно плавают в поле зрения микроскопа.

Постановка развернутой (количественной) РГА проводится в пластиковых панелях с равномерно округлым гладким дном или в пробирках в следующей последовательности (таблица 1):

Вначале готовят 2-кратные последовательные разведения вируссодержащего материала (от 1:2 до 1:2048). С этой целью в ряд лунок приливают 0,5 мл физраствора. Затем в 1-ю лунку добавляют 0,5 мл исследуемого вируссодержащего материала, перемешивают и 0,5 мл смеси переносят во 2-ю лунку и т.д. Из последней лунки 0,5 мл выли-

19

вают в дезинфицирующий раствор. Во все лунки добавляют по 0,5 мл 1 %-ной взвеси отмытых эритроцитов.

Одновременно ставят контроли:

1.Положительный контроль с разведением вакцинного вируса.

2.Отрицательный контроль с антигеном вируса другого вида.

3.Контроль эритроцитов для исключения возможности спонтанной гемагглютинации.

Для постановки контролей к 0,5мл физиологического раствора добавляют 0,5 мл 0,5...1 %-ной взвеси эритроцитов. В ряд лунок первого контроля добавляют 5 % взвесь эритроцитов. Перемешивают содержимое лунок осторожным встряхиванием планшеты и оставляют при комнатной температуре, в термостате (37˚С) на 30...60 мин или в холодильнике (4˚С) - 1-2 ч. (табл.1).

в) получение последовательных 2-кратных разведений вируса по 0,5 мл или по 0,2 мл;

г) добавление 1 %-ной суспензии эритроцитов; д) учет результатов и их интерпретация.

Таблица 1. Схема постановки реакции гемагглютинации (РГА)

3. Постановка реакции торможения (задержки) гемагглютинации (РТГА, РЗГА) и задержки гемадсорбции (РЗГАд)

Наиболее сложным и ответственным моментом постановки РТГА является приготовление рабочей дозы вируса (4 ГАЕ) и подготовка нативных сывороток крови. Очень важно, чтобы сыворотка на-

20