Серологическая диагностика инфекционных и инвазионных заболеваний животных и птиц. Учебное пособие

ла - это иммунноглобулины фракции Ig G, выделенные из иммунных сывороток и меченные флюорохромами (конъюгат). Для метки чаще используют флюоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ) (зеленое свечение) и РСХ – родамина сульфохлорид (красное свечение).

Меченный флюорохромом иммуноглобулин при нанесении на исследуемый мазок специфически адсорбируется на поверхности антигена, прочно с ним связываясь. Если антиген не комплементарен антителу, находящемуся в данной люминесцирующей сыворотке, то при промывании препарата такие антитела легко смываются.

Для выявления вируса в зараженных клетках, обнаружения антигенов вирусов в нативном исследуемом материале (в мазках из органов) используют прямой МФА (при изучении бешенства, оспы, болезни Борна).

Например, для диагностики бешенства отпечатки кусочков мозга животных, подозреваемых на вирусоносительство, обрабатывают люминесцирующей антирабической сывороткой. При положительном результате в цитоплазме нервных клеток выявляются глыбки яр- ко-зеленого цвета. На обнаружении антигенов вирусов в клетках маз- ков-отпечатков со слизистой оболочки носа основана экспрессдиагностика инфекционного ринотрахеита, гриппа, парагриппа-3 и аденовирусной инфекции.

С целью уменьшения неспецифической флюоресценции исследуемых препаратов применяют контрастирование неспецифического свечения. Исследуемые препараты при этом окрашивают смесью специфических флюоресцирующих антител, меченных ФИТЦ, обеспечивающих зеленое свечение, и альбумина нормальной сыворотки быка (БСА), меченного родамином, дающим красную люминесценцию фона.

Методика постановки РИФ

1. Препараты для люминесцентной микроскопии готовят на предметных стеклах, хорошо обезжиренных. Все надписи делают простым карандашом на матовой площадке у края предметного стекла. Несколько капель исследуемого материала наносят пастеровской пипеткой или бактериологической петлей вдоль предметного стекла. Если вирусы предварительно накапливают в культурах клеток, то последние выращивают на узких пластинках стекла. Извлеченные в разные сроки после заражения из пробирок с культурой клеток эти пластинки осторожно отмывают от питательной среды физиологическим раствором или фосфатным буфером, высушивают при комнатной температуре, положив клеточным слоем вверх на чис-

51

том листе фильтровальной бумаги.

2.Мазки и препараты культур клеток 15-20 мин фиксируют в охлажденном химически чистом обезвоженном ацетоне в закрытом сосуде.

3.Сухие специфические иммунные люминесцирующие сыворотки и альбумин перед окрашиванием мазков растворяют в дистиллированной воде в объеме, указанном на этикетке ампулы. Растворенными препаратами, сохраняемыми при +4° С, можно пользоваться в течение нескольких недель. Перед окраской исследуемых препаратов готовят рабочую смесь специфической люминесцирующей сыворотки с альбумином, меченым родамином.

4.Окрашивают мазки при 37° С в течение 30 мин во влажной камере, чтобы капли флюоресцирующей сыворотки не высыхали.

5.После этого избыток флюоресцирующих смесей смывают водой и препараты отмывают 10 мин в фосфатно-буферном растворе (рН 7,2-7,4), промывают дистиллированной водой и сушат при комнатной температуре на воздухе.

6.Исследуют с применением люминесцентного микроскопа, при работе с микроскопом МЛД обычно в качестве возбуждающих фильтров используют синие фильтры типа СС-4, СС-8 или ФС-1 и запирающие - типа ЖС-8. При люминесцентной микроскопии для иммерсии необходимо специальное нефлюоресцирующее масло (раствор глицерина). Заменителем его может служить диметилфталат.

7.Результаты иммунофлюоресцентной микроскопии учитывают по интенсивности и специфической флюоресценции исследуемого объекта; при одних вирусных инфекциях специфический антиген выявляется в цитоплазме пораженных клеток в виде ярко светящихся изумрудно-зеленых конгломератов различной величины и формы, при других инфекциях антиген обнаруживается в ядре. В поздней стадии инфекции может наблюдаться свечение всей массы цитоплазмы и ядра. Оценивают специфическое свечение по следующей шкале: «++++» - яркая, сверкающая флюоресценция изумрудно-зеленого цвета; «+++» - яркая флюоресценция зеленого цвета; «++» - слабая флюоресценция желтовато-зеленого цвета; + - очень слабая флюоресценция; « - » объект не флюоресцирует.

Для доказательства специфичности выявленной флюоресценции обязательно предусматривают контроли - микроскопию препаратов из материалов, не содержащих искомый вирус (нормальные тканевые культуры, отпечатки органов здоровых животных). Если в препарате обнаруживают 3-5 и более пораженных вирусом клеток, флюоресци-

52

рующих специфическим зеленым цветом на 3-4 креста при отрицательном контроле, результат считают положительным.

Более широко применяют метод непрямой иммунофлюоресценции, основанный на выявлении как антигена, так и антител к нему.

. Непрямой метод имеет преимущество перед прямым как более доступный: с помощью одной и той же антивидовой сыворотки, меченной флюорохромом, можно обнаружить различные вирусные антигены, применяя в каждом случае соответствующую немаркированную специфическую иммунную сыворотку против конкретного возбудителя инфекции

При люминесцентной микроскопии препаратов, обработанных по прямому или непрямому методу иммунофлюоресценции, при вирусных инфекциях специфический антиген выявляется в цитоплазме в виде ярко светящихся конгломератов различной величины и формы, располагающихся в ранней стадии инфекции клетки вблизи ядра. При других инфекциях антиген обнаруживается в ядре. В поздней стадии инфекции клеток наблюдается повреждение всей массы цитоплазмы и ядра. Для доказательства специфичности выявленной флуоресценции проводят два контроля. При прямом методе: 1) обработку специфической флюоресцирующей сывороткой клеток, не зараженных вирусом; 2) обработку специфической флюоресцирующей сывороткой клеток, зараженных вирусом, предварительно обработанных специфической немаркированной сывороткой. При непрямом методе: 1) обработку не зараженных вирусом клеток специфической немаркированной сывороткой с последующей обработкой их меченой антивидовой сывороткой; 2) обработку зараженных вирусом клеток нормальной сывороткой животного, от которого получена специфическая иммунная сыворотка, с последующей обработкой их меченой антивидовой иммунной сывороткой.

9.2.Радиоиммунный анализ (РИА)

Радиоиммунологический метод основан на применении радиоизотопной метки антигенов и антител, используется для определения вирусных заболеваний. Первоначально он был разработан как специфический метод измерения уровня циркулирующих в крови гормонов. В тест систему включены меченый радионуклидом антиген и антисыворотка к нему. РИА позволяет определить любое вещество в ничтожно малых количествах, что особенно важно в вирусологии. В РИА сочетается специфичность, свойственная реакциям антиген-антитело с чувствительность и простотой, которые дает применение радиоактивной метки. Для проведения РИА нужно иметь соответствующие антисыворотки и меченные радиоактивеной

53

меткой антигены. Функцию метки антигенов выполняет радиоактивный изотоп – обычно 125I или 3H. Эту метку затем используют для обнаружения присутствия связанного комплекса. Чаще всего метят антитела.

Принцип РИА не ограничивается иммунными системами. Его применяют и для систем, в которых вместо специфического антитела будет действовать специфический реагент или связывающее вещество.

При проведении РИА используют готовые стандартные коммерческие наборы реагентов. РИА очень перспективен в вирусологии. Он позволяет точно диагностировать вирусные болезни. Возможности РИА расширились в дифференциальной диагностике, благодаря использованию моноклональных антител, обладающих высокой специфичностью. Эти антитела способны распознавать на вирусных антигенах отдельные эпитопы (активные молекулярные зоны), что важно для разработки высокочувствительного РИА для диагностики. Учет реакции проводят с помощью счетчика Гейгера, гамма спектрофотометра или рентгеновской пленки на экране флуорографа.

9.3.Иммуноферментный анализ

(ИФА, ELISA- enzyme-linked immunosorbent assay).

ИФА основан на учете специфического взаимодействия гомологичного антигена с антителами по специфическому маркеру. Образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляется с помощью ферментной метки. Возможность использования ферментов в качестве метки в иммуноанализе обусловлена прежде всего их высокой каталитической активностью, позволяющей с помощью соответствующих

субстратных систем определить концентрации фермента в растворе на уровне 10-15 моль/л и ниже.

ИФА применяют в двух вариантах: гистохимическом и твердофазном. Гистохимический вариант отличается от РИФ тем, что для постановки реакции используют антитела, меченные не флуорохромом, а ферментом и учет реакции про водят не под люминесцентным, а обычным световым микроскопом или с помощью приборов, измеряющих интенсивность окраски реагента. Материалом для исследования на наличие вирусного антигена служат мазки-отпечатки различных органов, крови, культура клеток, гистосрезы. Гистохимический вариант ИФА или иммунопероксидазная реакция выполняются с помошью прямого или непрямого тестов. В непрямом варианте ИФА используют антивидовые иммунопероксидантные конъюгаты, приготовленные в специализированных учреждениях.

9.4. Методы иммуноблоттинга (ИБ)

54

Впрактике иммунологической диагностики вирусных инфекций существует иногда необходимость определять антитела к определенным белкам вируса, то есть спектр специфических антител. Если с этой целью использовать метод иммуноферментного анализа, то в таком случае предварительно из вирусного патогена выделяют и очищают необходимые антигены. Полученные белки наносят отдельно на твердую фазу. Таким компонентом реакции служит гидрофобная поверхность (нитроцеллюлозные фильтры, полипропилен, полистирол, керамические пробирки или панели, нейлоновые или стеклянные шарики).

Втвердофазном методе исследуются сыворотки крови, смывы с естественных полостей животных, различные биологические жидкости, поэтому в нем определяется как антиген вируса, так и антитела к нему.

При проведении реакции используют конъюгат (соединение) вирусспецифических антител или антивидовых иммуноглобулинов с ферментом. В качестве ферментов используется лизоцим, каталаза, пероксидаза, уреаза, щелочная фосфатаза и др. Это позволяет с помощью вещества, на которое действует данный фермент, и субстрата (ортофенилендиамин или тетраметилбензидин), меняющего свой цвет

вприсутствии продуктов расщепления последнего, учитывать реакции невооруженным глазом под световым микроскопом или при помощи специального аппарата ELISA – ридера - спектрофотометра, имеющего светофильтры 405 нм, а также 492 нм по оптической плотности. Чаще всего используют отчественные Униплан, Мультискан или аппаратуру ведущих западных фирм IDEXX, BioChek и др. Результаты реакции фиксируются в компьютере. Здесь же с помощью программ вычисляется уровень антител.

Иммунный блоттинг позволяет определять в сыворотке крови антитела одномоментно и в то же время дифференцированно ко всем диагностически значимым белкам вируса. В переводе с английского Western blot означает западный перенос (дословно - промакивание). История этого необычного термина следующая. Е. Southern в 1975 г. впервые предложил метод переноса из геля на мембрану электрофоретическн разделенных фрагментов ДНК. По автору метод и был назван Southern blot, что в переводе означает «южный перенос». Метод переноса молекул РНК, в свою очередь, был специалистами назван Northen blot «северный перенос».

В1970 г. были опубликованы результаты первых опытов по белковому блотингу. В продолжение традиций «географических» наименований методов переноса биологических макромолекул. Данный Метод стал именоваться «западным» переносом Western blot.

55

Полученный блот обрабатывается блокирующим раствором, содержащим индифферентные в антигенном отношении белки и/или неионные детергенты (Твин 20), молекулы которых блокируют на мембране свободные от антигена места. Затем лист мембраны разрезают на узкие полоски таким образом, чтобы каждая полоска содержала все антигенные фракции. Описанные этапы выполняются фир- мой-производителем.

Вкоммерческих тест-системах для определения антител методом иммунного блоттинга содержатся уже готовые к исследованию блоты (полоски, или стрипы). Пользователь проводит определение всего спектра специфических антител к белкам патогена по схеме непрямого метода. В качестве хромогена для проведения цветной (ферментативной) реакции используют растворимое бесцветное вещество, продукт которого приобретает окраску, становится нерастворимым и оседает (преципитирует) на нитроцеллюлозе.

Врезультате проведения последовательно иммунных и ферментативной реакций при наличии в исследуемой пробе антител к белкам патогена на блоте появляются темные поперечные полоски, расположение которых находится в зоне определенных белков патогена. Каждая такая полоса свидетельствует о наличии специфических антител к соответствующему антигену. Результат исследования, проведенного методом иммунного блотинга, выдается в виде перечисления антител к конкретным белкам патогена.

На первом этапе этого метода осуществляют электрофоретическое разделение смеси белков патогена в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). ДСН, являясь поверхностно активным веществом, равномерно обволакивает молекулы белка и придает всем им отрицательный заряд приблизительно равной величины. Поэтому молекулы движутся в электрическом поле в одном направлении, а скорость продвижения зависит только от размеров молекулы (молекулярной массы) белка.

Врезультате электрофоретической процедуры получают гелевую пластину, в толщине которой в виде отдельных тонких линейных зон располагаются белки. По направлению движения они разделяются

вследующем порядке: ближе к старту находятся белки большой молекулярной массы, порядка 120-150 кДа, а к финишу далее всех продвинулись протеины массой 5-10 кДа. На втором этапе гелевую пластину накладывают на лист нитроцеллюлозы, эту конструкцию помещают между электродами источника постоянного тока. Под действием электрического поля белки перетекают из пористого геля на более плотную мембрану, где достаточно прочно закрепляются. Наиболее широкое применение нашел твердофазный иммуноферментный ана-

56

лиз.

9.5. Твердофазный иммуноферментный анализ

Твердофазный иммуноферментный анализ – один из самых многофункциональных серологических методов диагностики инфекционных заболеваний, который применяют для определения с равной эффективностью как антигенов, так и антител. Метод основан на связывании антигена антителами, иммобилизованными на поверхности пластиковой лунки. Связавшийся антиген затем определяют с помощью второго антитела. Комплекс антитело-антиген-антитело затем определяют с помощью антииммуноглобулина, меченого ферментом. Существует множество вариантов этой схемы.

Главное преимущество метода – усиление, так как каждое антитело с ферментной меткой способно реагировать со многими молекулами субстрата с образованием окрашенного продукта. Это дешевый и надежный метод, который может найти разнообразное применение. Главный недостаток твердофазного иммуноферментного анализа – в том, что реакции происходят в жидкой фазе, и, следовательно, требуется аккуратно отмеривать растворы. Перекрестная контаминация между лунками может иметь катастрофические последствия. По этим причинам твердофазный иммуноферментный анализ выполняется только в специализированных лабораториях опытными специалистами. Созданы тест-системы для практического использования (так называемые CITE тесты). В большинстве случаев твердая лунка заменена специальной мембраной. Так как реакция происходит в жидкой фазе, важно следить за тем, чтобы мембрана не высыхала.

Методика постановки твердофазного ИФА

В случае использования 96-луночного планшета, в каждую лунку помещают гомологичные антитела (гамма-глобулин в нужной концентрации), заранее помеченные ферментом.

Панели инкубирут (при 370 С 1 час и 8 час при 40 С). Последовательность действий при дальнейшей постановке ИФА следующая:

1. Пластинки отмывают 3 раза по 5 мин специальными буферными растворами от не связавшихся компонентов.

2. В лунки вносят антиген и инкубируют при 370 С 2 ч. Свободные рецепторы антигена, находящегося в комплексе антигенантитело, связываются антителами. В результате на стенках лунок образуются специфические комплексы антиген-антитело.

3. В контрольные лунки вносят заведомо известные положительный и отрицательный антигены.

1. Микропанели промывают, как сказано в п .1.

57

2.В лунки вносят иммуноферментный конъюгат и инкубируют 1-2 ч при 370 С.

3.Микропанели промывают, как сказано в п. 1.

4.В лунки вносят определенный субстрат, разлагающийся под действием примененного фермента.

5.Инкубируют в темноте при 18-220 С 5 –30 мин.

6.Останавливают реакцию добавлением кислоты или щелочи (в зависимости от примененного фермента).

7.Реакцию учитывают визуально по окраске жидкости под влиянием воздействия фермента и по разнице окраски опытных и контрольных образцов. Слабое окрашивание воспринимается как сомнительная реакция.

Автоматизированный учет проводят колометрически по длине волны на флюориметре, фотоэлектроколориметре, спектрофотометре. За положительный результат принимают превышение оптической плотности опытных образцов над контрольными в 5 –10 раз.

По наличию положительной реакции в лунке с тем или иным антигеном можно судить о наличии соответствующих специфических антител. Такого рода иммуноферментные тест-системы предлагаются фирмами-производителями, однако, широкое распространение, благодаря большей информативности и простоте исполнения самого исследования, получил метод иммунного блоттинга (Western blot).

Антитела непрямым методом твердофазного ИФА определяют при постановке реакции в следующей последовательности с обязательным промываением после каждого этапа:

1.В лунки планшета вносят антиген и адсорбируют его инкубированием.

2.Вносят исследуемые разведения сывороток крови от животных. Специфические антитела адсорбируются на антигене.

3.Вносят антивидовой глобулин, меченый ферментом. Он фиксируется на антителах, ранее введенных как антиген для них.

4.Вносят субстрат и учитывают реакцию при появлении цветного продукта ферментативной реакции.

9.6.Метод иммуноферментного анализа (ИФА)

сиспользованием индикаторных полосок

Вданном методе используется система ферментных каналов, предусматривающая включение двух ферментов. Эта пара подбирается таким образом, чтобы продукты одной ферментативной реакции служили субстратами для второго фермента. Поверхность индикаторной полоски покрыта антителами против вирусного антигена. Вместе с антителами на твердой фазе иммобилизованы молекулы

58

фермента глюкозооксидазы. Готовую полоску погружают в исследуемый образец. Антитела связывают молекулы антигена из образца. Степень заполнения вакантных антител пропорциональна концентрации вирусного антигена. Затем индикаторную полоску переносят в раствор, содержащий конъюгат стандартного антигена с пероксидазой, субстрат для глюкозооксидазы (глюкозу) и хромоген (4-хлориафол).

Глюкозооксидаза катализирует превращение глюкозы в глюконовую кислоту с образованием перекиси водорода. Конъюгат связывается свободными антителами на полоске, и пероксидаза оказывается в непосредственной близости от области наибольшей концентрации перекиси водорода. Атомарный кислород, образующийся в результате ферментативного расщепления перекиси, окисляет хромоген. В результате образуется нерастворимое соединение голубого цвета, которое проявляется на полоске.

Интенсивность развивающейся окраски обратно пропорциональна концентрации определяемого вещества в образце. Регистрацию проводят визуально или с помощью фотометра, предназначенного для измерения отраженного света. Такой вариант иммуноферментного анализа не требует промывок и разделения связанных и свободных молекул конъюгата. Анализируемый материал (сыворотки, слюна, моча) не требует предварительного разведения и дополнительной обработки.

Для упрощения интерпретации полученных результатов в индикаторные полоски вводят внутренний стандарт. На индикаторной полоске в отдельном месте иммобилизуют антитела к пероксидазе. Концентрацию антипероксидазных антител подбирают в такой концентрации, чтобы связанный ими конъюгат пероксидаза-антиген содержал некоторое диагностически значимое количество антигена. Интенсивность окраски зоны внутреннего стандарта сравнивают с окраской основной части индикаторной полоски. Если таковая превышает зону опытного образца, значит концентрация определяемого вещества больше условной концентрации антигена внутреннего стандарта.

Диагностическая ценность метода очень высокая: метод

ELISA завоевал популярность вследствие простоты, скорости, низкой цены. При этом отсутствует необходимость оценивать протекающую реакцию по вторичным проявлениям, таким как агглютинация, преципитация, лизис эритроцитов. Методы с использованием твердой фазы (пластмасса, целлюлоза, сефадекс) существенно упростили процесс и возможность автоматизации процедур. Компоненты реакции могут храниться длительное время. ИФА очень легко поддается авто-

59

матизации. Измерение оптической плотности проводят в оптическом диапазоне, результаты ИФА можно также оценивать без применения аппаратуры.

Достоинством метода является чрезвычайно высокая специфичность и чувствительность (точность), воспроизводимость результатов, что позволяет проводить раннюю диагностику вирозов.

Метод твердофазного ИФА очень удобен для скрининга больших количеств образцов малого объема. Это особенно важно при эпизоотологических обследованиях, массовой диагностике инфекционных заболеваний, а также для контроля эффективности вакцинации сельскохозяйственных животных и птиц. На одном рабочем месте в течение одного дня ИФА дает возможность исследовать до 1000 анализов сывороток крови от животных и птиц.

Широкое применение ИФА нашел в диагностике возбудителей инфекционной бурсальной болезни птиц, инфекционного бронхита птиц, гриппа, ньюкаслской болезни, инфекционной анемии птиц и многих др. заболеваний животных и птиц.

Вопросы домашнего задания

1.В чем отличие РИФ, ИФА, РИА?

2.Принцип РИФ.

3.Постановка и учет прямой РИФ.

4.Постановка и учет непрямой РИФ.

5.Каковы достоинства и недостатки РИФ?

6.Принцип РИА.

7.Принцип ИФА.

8.Чем отличается гистохимический ИФА от твердофазного ИФА? Каковы достоинства и недостатки ИФА?

60