Серологическая диагностика инфекционных и инвазионных заболеваний животных и птиц. Учебное пособие

тиугольника (1-й вариант расположения лунок) пастеровской пипеткой наливают 2-3 капли преципитирующей сыворотки или специфического гамма-глобулина, в четыре периферийные - исследуемые антигены, в пятую - специфический антиген (контроль №1), в шестую - антиген из нормальной ткани (контроль № 2). В центральную лунку правого шестиугольника наливают 2-3 капли нормальной сыворотки, а в остальные - исследуемые антигены, антиген из нормальной ткани, стандартный вирусный антиген (соответственно контроли № 3-8). Компоненты РИД вносят с таким расчетом, чтобы у верхнего края образовался несколько вогнутый мениск и жидкость не растекалась по поверхности агара.

После заполнения лунок чашки Петри закрывают крышками и помещают во влажную камеру при температурах, 4˚С, 18...25˚, 37...38˚ С на 24-72 ч (в зависимости от вида вируса). Реакцию оценивают визуально в косопроходящем или отраженно-рассеяном свете, начиная с контрольной. В нашем примере полосы преципитации наблюдают в контроле 1, в контролях № 2-8 их не должно быть. Если исследуемые антигены (левый шестиугольник) специфичны антителам преципитирующей сыворотки, то между центральной лункой и первыми четырьмя лунками периферии образуются полосы преципитации.

При определении антител постановка реакции методически осуществляется аналогично, лишь с той разницей, что в центральную лунку левого шестиугольника наливают стандартный антиген, а в четыре периферические - исследуемые сыворотки, в пятую - стандартную преципитирующую сыворотку (контроль № 1), в шестую - нормальную сыворотку (контроль № 2). В центральную лунку правого шестиугольника вносят контрольный антиген, а в периферические - исследуемые сыворотки, положительную и нормальную сыворотки (контроль № 3-8). Вначале учитывают результат контрольной реакции. Если в исследуемых сыворотках содержатся преципитины, соответствующие антигену, между центральной лункой и первыми четырьмя лунками, расположенными по периферии, наблюдают полосы преципитации.

Для микропреципитации в агаре на предметных стеклах необходимы чистые, тщательно обезжиренные предметные стекла. Их помещают на горизонтальную поверхность (стол). Слегка подогретой пипеткой (40...45˚) набирают нужное количество (3-4 мл) расплавленного (50...60˚) 1 %-ного агарового геля и выливают на поверхность стекла. Толщина слоя агара при этом должна быть 1...1,5 мм. После застывания агара на поверхности каждого стекла стандартными

41

штампами выдавливают лунки, из которых затем отсасывают агар. Размеры и форма штампа могут быть различными, в зависимости от цели опыта. Затем в лунки пастеровскими пипетками с тонко оттянутыми концами или микропипетками наливают антигены и антисыворотки (аналогично макрометоду). После заполнения луночек реагентами стекла помещают во влажную камеру (чашка Петри с фильтровальной бумагой, смоченной водой; эксикатор с герметически закрывающейся крышкой и др.) и оставляют при комнатной температуре или ставят в термостат (37˚С).

Предварительный учет результатов РИД производят через 8...10 ч, основной - через 24 ч и окончательный - через 48...72 ч.

При оптимальном соотношении антигенов (АГ) и антител (AT) после окончания диффузии линия преципитации располагается примерно на середине расстояния между лунками, перпендикулярно к оси, соединяющих центра. Если один из компонентов реакции присутствует в большем количестве, чем другой, то линия преципитации сдвигается в сторону лунки с меньшим содержанием реагента. При достаточно высокой концентрации компонентов реакции она может достигать соседнего сектора агаровой пластинки, в котором формируются полосы преципитации другой антигенной системы. Характер расположения полос определяет степень родства антигенов. Принципиально возможны четыре варианта расположения линий преципитации.

1. Обе линии преципитации полностью сливаются. Это говорит об идентичности обоих антигенов.

2.Линии преципитации пересекаются. Это значит, что реагирующие с AT детерминанты АГ неидентичны и, следовательно, сами антигены различны.

3.Одна линия длиннее и продолжается за другую в виде так называемой "шпоры". "Шпора" часто бывает тоньше основной линии преципитации. Линия преципитации от второй лунки с АГ сливается

спервой линией. Это означает, что оба антигена обладают некоторыми общими детерминантами и образуют с соответствующими AT иммунные комплексы, приводящие к слиянию линий. Кроме того, один из АГ имеет больше детерминант, чем другой, что при наличии соответствующих AT в антисыворотке приводит к образованию "шпоры".

4.Обе линии преципитации перекрещиваются и сливаются одновременно. Это значит, что оба антигена содержат как одинаковые, так и различные детерминанты, которые вступают в реакцию с антителами полиспецифической сыворотки.

42

определения вида или типа вируса. Ее применяют для диагностики многих вирусных инфекций (ящура, энцефаломиелита лошадей и др.).

Сущность реакции состоит в том, что здесь участвуют две системы: специфическая (исследуемая сыворотка + антиген) и индикаторная (гемолитическая сыворотка или гемолизин + взвесь эритроцитов барана). Связующим компонентом между ними является комплемент. В зависимости от того, где он адсорбируется, наблюдают тот или иной исход реакции. Если комплемент используется в специфической системе - реакция положительная, индикаторной - отрицательная. Положительная реакция характеризуется задержкой гемолиза (эритроциты находятся во взвеси - жидкость мутная, красного цвета), отрицательная - полным гемолизом (лизис эритроцитов - жидкость прозрачная, красного цвета.

Диагностическая ценность. РСК уступает по чувствительности и специфичности РН, РИФ и РТГА. Тем не менее, она находит широкое применение в вирусологии из-за простоты постановки, отсутствия необходимости в концентрированных и высокоочищенных антигенах, групповой специфичности комплементсвязывающих антител. Последнее обстоятельство дает возможность применять РСК определения антигена вируса и для изучения антигенных взаимосвязей вирусов.

Компоненты реакции следующие: исследуемая сыворотка крови (исследуемый антиген), стандартный вирусный антиген (стандартная сыворотка), гемолитическая сыворотка или гемолизин, эритроциты барана, комплемент. В качестве разбавителя используют изотонический раствор хлорида натрия (рН 7,2... 7,4) (приложение 5).

Рис. 3. Реакция связывания комплемента: а - положительная (за-

44

держка гемолиза); б - отрицательная (гемолиз).

Постановка РСК при вирусных инфекциях значительно отличается от постановки ее при бактериальных инфекциях. Это обусловлено рядом специфических свойств вирусов.

1.Для освобождения вирусного антигена приходится обрабатывать инфекционный материал с целью извлечения его из клетки.

2.Вирусные антигены не отличаются высокой устойчивостью, поэтому материал для их получения берут от павших животных в первые часы гибели, а лучше при жизни. Консервирование вируссодержащего материала часто не дает положительных результатов, так как многие из них вызывают разрушение вирусного антигена.

3.Неравномерность фиксации комплемента при различном соотношении концентраций антиген-антитело. Комплекс антиген + антитело образуется только при строгих количественных соотношениях этих компонентов. При избытке антител фиксация комплемента резко снижается. То же наблюдают и при избытке антигена, где подавление фиксации происходит еще быстрее. Поэтому для установления оптимальной дозы комплемента необходимо предварительное титрование антигена и антитела.

4.Незначительный объем комплекса антиген-антитело. Размер вирусных частиц, вступающих в этот комплекс, а следовательно, и площадь фиксации комплемента небольшие. С увеличением объема комплекса антиген-антитело путем удлинения периода фиксации компонента повышается чувствительность реакции, но снижается ее специфичность, так как увеличивается фиксация комплемента неспецифическими тканевыми антигенами.

5.Высокая комплементарная активность вирусных антигенов. В своем составе они содержат тканевые антигены, что мешает проведению реакции (неспецифическая фиксация комплемента). Для исключения этого явления необходима более полная очистка вирусных антигенов от тканевых фрагментов.

Кроме того, существенной помехой для РСК при диагностике вирусных заболеваний животных и человека является неравномерное накопление антигена и антител в различные периоды болезни и особенно при разных инфекциях. Поэтому постановка РСК должна иметь особенности не только в зависимости от характера заболевания, но и от ее цели (обнаружение антигена, антител, титрование вируса и т.д.).

Для повышения чувствительности РСК требуется некоторое изменение методики ее постановки - связывание комплемента в РСК при вирусных инфекциях проводят длительно (18...20 ч) и на холоде

45

(О...4° С). В этих условиях антиген и антитело успевают прореагировать наиболее полно, что повышает чувствительность реакции. Однако, несмотря на трудности постановки РСК, эта реакция нашла применение для обнаружения вируса в исследуемом материале. Типичным примером может служить постановка РСК для обнаружения вируса ящура, определения его типа и варианта.

Антигены и предъявляемые к ним требования: 1) достаточно высокая антигенная активность; 2) отсутствие примесей антигенов организма хозяина; 3) отсутствие компонентов, обладающих антикомплементарной активностью; 4) безопасность в отношении распространения инфекции и безвредности для работающего персонала; 5) хорошая сохраняемость при разных температурных режимах; 6) стандартность антигена.

Методика постановки РСК следующая:

1. Титрование гемолизина. Гемолизин титруют при получении его новой серии. Выпускаемый биофабриками гемолизин часто консервирован глицерином (1:1). Вначале готовят основное разведение 1:100. Для этого берут 0,2 мл гемолизина и 9,8 мл физраствора. Из него готовят разведение 1:1000 - к 1 мл гемолизина 1:100 добавляют 9 мл физраствора. Из основного раствора (1:1000) готовят все последующие разведения по указанной ниже схеме (табл.7). Получив необходимые разведения гемолизина, проводят его титрование (табл.8). При этом необходимы следующие контроли: 1) контроль эритроцитов для исключения спонтанного гемолиза (0,5 мл 2 %-ной суспензии эритроцитов + 2 мл физиологического раствора); 2) контроль гемолизина для исключения гемолиза эритроцитов без комплемента (0,5 мл разведения 1:1000 гемолизина + 0,5 мл 2 %-ной взвеси эритроцитов + 1,5 мл физиологического раствора); 3) контроль комплемента для исключения гемолиза эритроцитов без участия гемолизина (0,5 мл 1:20 комплемента + 0,5 мл 2 %-ной взвеси эритроцитов + 1,5 мл физиологического раствора); 4) контроль гемолитической системы (0,5 мл разведения 1:1000 гемолизина + 0,5 мл 2 %-ной взвеси эритроцитов + 0,5 мл разведения 1:20 комплемента – 1 мл физиологического раствора).

При титровании устанавливают предельный титр гемолизина, т.е. его минимальное количество, способное вызвать лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В нашем примере (табл.8) - это количество гемолизина в разведении 1:3000. В первых трех контролях должна быть полная задержка гемолиза, в четвертом контроле - полный гемолиз.

46

В главный опыт берут 4-х-кратную концентрацию гемолизина от его предельного титра. Значит, рабочее разведение будет 1:750. А если он консервирован глицерином (1:1), то для приготовления рабочего разведения берут 2:750 или 0,2 мл цельного гемолизина и 74,8 мл физиологического раствора.

2.Приготовление гемолитической системы. Смешивают гемо-

лизин в рабочем титре с равным количеством 2 %-ной взвеси эритроцитов барана. Перед использованием гемолитическую систему выдерживают в термостате 30 мин при 37° С для сенсибилизации эритроцитов.

3.Приготовление 2 %-ной суспензии эритроцитов. К 2 мл осадка отмытых эритроцитов барана добавляют 98 мл физиологического раствора.

Таблица 7. Схема приготовления разведений гемолизина

Таблица 8.Схема титрования гемолизина

*Обозначения: ПГ - полный гемолиз; ЧЗГ - частичная задержка гемолиза; ЗГ - задержка гемолиза.

4. Титрование комплемента. Комплемент титруют в гемолитической системе в день главного опыта по схеме, приведенной в

47

(табл.7, 8).

Титром комплемента считают то его наименьшее количество, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов. При определении типа вируса ящура используют комплемент с титром, не ниже 2,5 %.

Для постановки главного опыта РСК комплемент берут с избытком в 1 % или в две условные единицы от его титра в гемсистеме. Например, титр комплемента в гемсистеме 2 %, в главный опыт берут 3 %. Для приготовления рабочей дозы к 3 мл нативного цельного комплемента добавляют 97 мл физиологического раствора.

Приготовление разведений комплемента, определение его активности и вычисление рабочей дозы требуют в подготовке РСК наибольшего внимания. Правильно выбранная рабочая доза комплемента непременное условие нормального течения реакции, что обеспечивает достоверность результатов.

При определении типа вируса ящура типоспецифические сыворотки и стандартные антигены, выпускаемые биофабриками, используют в удвоенном предельном титре. Например, если титр сыворотки, указанный на этикетке, равен 1:40, рабочий титр равен 1:20.

5. Постановка главного опыта. Одновременно с главным опы-

том ставят контроль всех специфических ящурных антигенов и сывороток согласно схеме (табл.9). Компоненты разливают в следующем порядке:

1)специфические сыворотки в рабочем титре по 0,2 мл для каждой сыворотки — один ряд по вертикали;

2)специфические антигены в рабочем титре по 0,2 мл - в первые семь рядов по горизонтали, для каждого антигена один ряд;

3)испытуемый антиген в разведениях по 0,2 мл - для каждого разведения один ряд пробирок по горизонтали;

4)физиологический раствор по 0,2 мл - в последний ряд по горизонтали (контроль сывороток) вместо антигена и в последний ряд по вертикали (контроль антигенов) вместо сывороток;

5)комплемент по 0,2 мл в рабочем разведении - во все пробирки главного опыта.

Пробирки осторожно встряхивают и помещают в водяную баню на 20 мин при 37...38° С.

6)во все пробирки наливают по 0,4 мл гемолитической системы. Пробирки снова встряхивают и ставят в водяную баню на 30 мин при

37...38° С.

Микрометод РСК. В последнее время для количественного учета РСК применяют технику постановки реакции в малых объемах. Для этого используют наборы панелей с V-образной конфигурацией лунок и калиброванных капельных пипеток системы Таккачи. Реак-

48

цию ставят в объеме 0,125 мл, т.е. в 8 раз меньшем, чем при описанном выше методе. Каждый компонент берут в объеме 0,025 мл.

Примечание: все стандартные антигены и сыворотки активны и специфичны. Испытуемый антиген относится к типу А.

Техника подготовки реагентов, приготовление стандартов и постановка реакции такие же, как и при макрометоде. Небольшой расход реагентов и быстрота разлива компонентов капельными микропипетками делают микрометод очень удобным при постановке перекрестных реакций, когда определяют антигенное родство нескольких штаммов.

Если испытуемый антиген гомологичен специфическим антителам, то будет задержка гемолиза и реакция считается положительной: если же гомологичные антитела отсутствуют - реакция отрицательная и наблюдается полный гемолиз.

Таблица 9. Схема главного опыта РСК по определению типа вируса ящура

49