Серологическая диагностика инфекционных и инвазионных заболеваний животных и птиц. Учебное пособие

дежно работала с вирусом. Самым доступным и полностью отвечающим назначению является вирус ньюкаслской болезни (штамм Н) и специфическая сыворотка к нему (из диагностического набора). Специфическую сыворотку к вирусу ньюкаслской болезни в большом количестве можно получить путем гипериммунизации кроликов.

Освобождение сывороток от ингибиторов имеет смысл провести демонстрационно для всей группы. При выполнении данной работы группу делят на подгруппы в зависимости от наличия на кафедре материальных средств.

Краткие теоретические сведения

В последние годы специфичность и чувствительность серологических реакций повысилась, благодаря приготовлению высокоочищенных антигенов, иммунных сывороток и совершенствования техники их постановки.

Вскоре после открытия РГА было установлено, что противовирусные сыворотки, соединенные с соответствующим вирусом, способны нейтрализовать его гемагглютинирующую активность, т.е. задерживать процесс гемагглютинации. Этот феномен стал использоваться в одной из простейших серологических реакций - реакции торможения (РТГА) гемагглютинации или задержки (РЗГА).

РТГА (РЗГА) - высокоспецифическая серологическая реакция, основана на феномене предотвращения (торможения) иммунной сыворотки гемагглютинации эритроцитов вирусами. Она позволяет решить следующие задачи: выявить противовирусные антитела, определить их титр; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известней сыворотке; установить антигенное родство двух гемагглютинирующих вирусов.

РТГА служит основным методом серодиагностики гриппа, ньюкаслской болезни птиц, парагриппа-3 КРС, вирусного аборта овец и других вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглютинирующими свойствами. Для этого используют парные пробы сывороток, взятые с интервалом в 2...3 недели, и по приросту титра антител в 4 и более раз определяют заболевание.

Достоинства РТГА: простота техники постановки, быстрота ответа, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна.

Диагностический недостаток реакции – постановка РТГА возможна только с гемагглютинирующими вирусами или сывороткой крови от животных, зараженных гемагглютинирующими вирусами.

Сущность РТГА заключается в том, что при взаимодействии противовирусной иммунной сыворотки с соответствующими штам-

21

мами вируса происходит задержка (торможение) гемагглютинирующей способности вируса. На результат РТГА влияют неспецифические термостабильные альфа-ингибиторы гемагглютинации и термолабильные бета-ингибиторы, содержащиеся в сыворотках крови. Они обладают способностью вступать в связь с вирусами и тормозить гемагглютинацию. С целью ликвидации отрицательного влияния ингибиторов на ход реакции их необходимо разрушить (удалить). Для этого используют несколько методов.

Термолабильные ингибиторы инактивируются обработкой сыворотки крови на водяной бане при температуре 56-65˚С (в зависимости от вида животного) в течение 30 мин.

Термостабильные ингибиторы удаляются из сыворотки крови химическими или физическими воздействиями (см. Приложение 3, п. I).

Компоненты РТГА: 1-й вариант постановки - исследуемый вируссодержащий материал; диагностическая иммунная сыворотка; 1 %-ная взвесь эритроцитов; 2-й вариант - исследуемая сыворотка крови; стандартный антиген (вирусный диагностикум); 1 %-ная взвесь эритроцитов.

Постановка РТГА предусматривает следующие этапы:

1. Предварительный этап включает определение 1 ГАЕ и рабо-

чей дозы вируса (4 ГАЕ), определение правильности выбора рабочей дозы вируса.

Вначале в РГА определяют 1 ГАЕ, а для основного опыта используют от 2 до 8 ГАЕ, чаще всего 4 ГАЕ. Например, если 1 ГАЕ вируса соответствует разведению 1:160, то при подготовке рабочей дозы (4 ГАЕ) вирус разводят 1:40. Вирус в рабочем разведении готовят в объеме, необходимом для проведения основного опыта. Для приготовления рабочего разведения 1:40 берут 1 мл исходного вируса и 39 мл физиологического раствора. Правильность приготовления рабочей дозы (4 ГАЕ) определяют в дополнительном опыте. Для этого используют пластмассовую панель. В лунки панели, начиная со второй и включая шестую (контроль), вносят по 0,1 мл физраствора. Затем в первую лунку вносят 0,1 мл вируссодержащего материала (4 ГАЕ) и делают последовательные переносы. Из пятой лунки 0,1 мл выливают в дезраствор, в контрольную лунку вирус не добавляют. Получают разведения вируссодержащего материала в 4 ГАЕ, 2 ГАЕ, 1 ГАЕ, 0,5 ГАЕ и 0,25 ГАЕ. Затем в каждую лунку, в том числе и контрольную, вносят по 0,1 мл 1 %-ной взвеси эритроцитов кур. Реакцию оставляют при комнатной температуре на 45...50 мин и проводят учет (табл. 2).

22

При правильном выборе 4 ГАЕ в первых двух лунках - агглютинация эритроцитов на +++, в третьей (1 ГАЕ) - ++, в контроле агглютинация отсутствует.

2. Основной опыт РТГА

Основной опыт РТГА (для определения антител в исследуемой сыворотке). В лунки пластмассовой панели разливают по 0,2 мл физиологического раствора. Затем в первую лунку вносят 0,2 мл исследуемой сыворотки и делают последовательные ее переносы. Из последней лунки 0,2 мл разведенной сыворотки выливают в дезраствор. Таким образом, получают разведения исследуемой сыворотки от 1:2 до 1:256. В каждую лунку вносят по 0,2 мл вируссодержащего материала в 4 ГАЕ и оставляют при комнатной температуре на 20 мин. По истечении этого времени в каждую лунку добавляют по 0,4 мл 1%- ной взвеси эритроцитов кур и снова оставляют при комнатной температуре на 30-45 мин (эритроциты курицы) или 60 мин (эритроциты млекопитающих).

Одновременно ставят контроли: а) контроль сыворотки на са-

моагглютинацию (0,2 мл разведенной 1:20 сыворотки крови добавляют 0,2 мл физраствора и 0,4 мл 1 %-ной взвеси эритроцитов кур); испытуемая сыворотка крови не должна давать агглютинацию. Если она наступает, то ее надо истощить (см. Приложение 3, п. II).

б) контроль эритроцитов (0,4 мл 1 %-ной взвеси эритроцитов кур и 0,4 мл физраствора);

в) положительный контроль на специфичность вируса со стандартной гипериммунной сывороткой. (0,4 мл антигена в 4 ГАЕ и 0,4 мл 1%-ной взвеси эритроцитов кур). При наличии антител в сыворотке наступает задержка агглютинации эритроцитов. В последних пробирках, где имеется слабая концентрация сыворотки, будет наблюдаться полная агглютинация эритроцитов.

Таблица 2роверка правильности выбора 4 ГАЕ

23

РТГА позволяет не только выявить специфические антитела, но и определить их титр.

Титром антител в РТГА называют наименьшее их количество в сыворотке (наивысшее разведение сыворотки), способное полностью тормозить гемагглютинацию, т. е. еще дающее определенный эффект при взаимодействии с гомологичным антиге-

ном. В приведенном примере (табл.3) титр антител, т.е. концентрация их в сыворотке крови составляет 1:32.

Реакция задержки гемадсорбции (РЗГад)

Ее применяют для обнаружения, идентификации и типизации вирусов в зараженной культуре клеток. Суть ее состоит в том, что антитела иммунной сыворотки, взаимодействуя с антигеном гемагглютинирующих вирусов, размножающихся в культуре клеток, нейтрализуют их, и в результате адсорбция эритроцитов на поверхности зараженных клеток не наблюдается.

Компоненты реакции:1) инфицированная и неинфицированная гемагглютинирующим вирусом культура клеток в пробирках; 2) диагностическая противовирусная сыворотка; 3) 0,4 %-ная взвесь эритроцитов кур.

Техника постановки. Из пробирок с культурой клеток сливают питательную среду, отмывают клетки от ее белковых компонентов, добавляя в пробирки 2-3 мл раствора Хенкса. После 1...2 мин экспозиции раствор Хенкса удаляют. Затем в каждую опытную и контрольную пробирки вносят по 0,2 мл диагностической сыворотки. Пробирки оставляют в наклонном положении, полосой вверх, и выдерживают при комнатной температуре 15...20 мин. Затем добавляют по 0,2 мл 0,4%-ной взвеси эритроцитов и снова оставляют на 3...5 мин в наклонном положении при комнатной температуре. В дальнейшем пробирки осторожно вращают 5-10 раз с целью ресуспендирования осевших, но не адсорбировавшихся эритроцитов.

Одновременно ставят следующие контроли:

1)контроль культуры клеток в норме (ростовую среду меняют на поддерживающую);

2)контроль диагностического (известного) вируса (клеточный монослой + вирус);

3)контроль нормальной сыворотки (клеточный монослой + нормальная сыворотка).

Учет РЗГад проводят под малым увеличением микроскопа. При положительной реакции эритроциты свободно плавают в поле зрения. Это обусловлено тем, что гемадсорбирующая способность вируса

25

нейтрализована антителами специфической сыворотки. При отрицательной реакции происходит адсорбция эритроцитов на поверхности клеток.

4. Самостоятельная работа слушателей. Задание для самостоятельной работы:

1.Ознакомиться с компонентами РЗГА и реакции задержки гемадсорбции.

2.Поставить и учесть результат РЗГА.

3.Просмотреть в микроскопе пробирки с положительным и отрицательным результатами реакции задержки гемадсорбции.

Контрольные вопросы

1.Что такое титр вируса?

2.Каковы единицы измерения количества вируса?

3.В чем принцип определения титра вируса в единицах 50 %- ного инфекционного действия?

4.Каковы достоинства и недостатки разных методов титрования вирусов?

5. Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА, РПГА)

Реакция непрямой гемагглютинации обладает высокой чувствительностью и позволяет решить следующие диагностические задачи:

1)обнаружить антитела и определить их титр в исследуемых сыворотках крови (метод Бойдена с эритроцитарным антигенным диагностикумом);

2)обнаружить и идентифицировать неизвестный вирусный антиген (метод Рыцая с эритроцитами, сенсибилизированными специфическими антителами).

В реакции используют эритроциты или нейтральные синтетические материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых сорбированы вирусные антигены или антитела.

Сущность реакции в том, что агглютинация эритроцитов происходит при добавлении соответствующих антигенов или сывороток. Эритроциты выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген-антитело.

Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называют антигенным эритроцитарным диагностикумом и используют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные анти-

26

телами, называют иммунноглобулиновыми (антительными) эритроцитарными диагностикумами и применяют для быстрого обнаружения антигенов в различных субстратах.

Регистрируют данную реакцию по характеру образовавшегося осадка эритроцитов, т.о. она является сугубо специфической серологической. Необходимо отметить, что РНГА отличается от РГА. В РГА эритроциты агглютинируются с рецепторами вирусов за счет своих комплементарных рецепторов. В то же время в РНГА агглютинация происходит за счет образования комплексов антиген + антитело

(рис.2).

Достоинства РНГА (РПГА). Эта реакция обладает высокой чувствительностью, превосходят РИД, РСК и по диагностической ценности, приближаясь к иммуноферментному анализу, отличается простотой техники постановки и быстротой ответа (2...3 ч). РПГА используют для диагностики гриппа, аденовирусной инфекции, пара- гриппа-3, вирусного энтерита, респираторно-синтициальной инфекции, инфекционного ринотрахеита и др.

Недостатом реакции являются определенные трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов. (необходима высокая чистота компонентов, необходимость разработки режима сенсибилизации для каждого вида вируса и т.д.).

Компоненты реакции

Для определения антител в исследуемых сыворотках необходимо иметь: а) антигенный эритроцитарный диагностикум; б) исследуемую сыворотку крови; в) разбавитель (в нем ставится реакция).

Для определения антигенов в исследуемых биологических жидкостях необходимо иметь: а) антительный эритроцитарный диагностикум; б) исследуемый биологический субстрат; в) разбавитель (приложение 3).

Постановка РНГА включает следующие основные этапы:

а) приготовление растворов и подготовка исследуемых жидко-

стей;

б) получение эритроцитарных диагностикумов; в) постановка главного опыта РНГА.

Обычно в лабораториях ставят только главный опыт, а остальные процедуры проводят на предприятиях биологической промышленности.

Основной опыт РНГА. Реакцию ставят в лунках пластмассовых панелей. В последнее время применяют микрометод с помощью прибора Такачи или др. Исследуемые и контрольные сыворотки прогре-

27

Титр антител — 1:64 «++++» - хорошо выраженный "зонтик" (осадок на дне пробирки

с неровными краями) с загибающимися краями; «+++» - "зонтик" с ровными краями;

«++» - "зонтик" со слабо выраженным кольцом по краю; «+» - отчетливо выраженное кольцо на фоне слабо выраженного

"зонтика"; «-» - на дне лунки компактная «пуговица» из эритроцитов.

За титр антител в сыворотке принимают наибольшее ее разведение, которое вызывает агглютинацию эритроцитов не ниже, чем на «++». В нашем примере (табл.4) титр антител составляет 1:64.

В ходе самостоятельной работы слушателей необходимо:

1.Подготовить микропанели, петли и пипетки для РНГА.

2.Поставить РНГА и провести её учёт с целью определения титра антител в сыворотке.

Вопросы домашнего задания:

1.Сущность, схема постановки и учет реакции нейтрализации.

2.Сущность, схема постановки и учет реакции иммунодиффу-

зии.

6. Реакции нейтрализации (РН)

На одном занятии всю РН поставить невозможно, поэтому используют изготовленный набор с фиксированными спиртом культурами клеток (нормальных и с ЦПД), подобранных так, что образуется реакция нейтрализации. Для этого предварительно выращивают в пробирках (не менее 50) культуры клеток любого типа и примерно в половине из них заменяют питательную среду на 70 %-ный этиловый спирт (2...3 мл на пробирку), предварительно отмыв монослой физиологическим раствором. Такие фиксированные культуры клеток хорошо сохраняются на горизонтальных (с уклоном 5˚) штативах при комнатной температуре многие месяцы, оставаясь удобными для просмотра и мало отличаясь по виду от живых. Вторую половину проби-

29

рок с культурами клеток заражают вирусом, способным вызвать в них ЦПД. После образования ЦПД эти культуры также фиксируют в спирте. Подбирая затем комбинации пробирок с ЦПД и без него по группам, соответствующим предполагаемым разведениям сыворотки, составляют набор с произвольной схемой РН, снабдив пробирки номерами. На одну учебную группу необходимо иметь четыре таких набора, имитирующих РН. Студенты, кроме практического знакомства с РН, приобретают дополнительные навыки в оценке действия вирусов на культуры клеток.

Краткие теоретические сведения

Реакция нейтрализации широко используется в вирусологической практике. Она предназначена для идентификации выделенного вируса, определения наличия антител и изменения их титра в сыворотке крови больных и переболевших животных, установления количественного содержания антител в лечебных, профилактических и диагностических препаратах (гамма-глобулины, диагностические сыворотки).

Сущность реакции нейтрализации заключается в способности вируснейтрализующих антител иммунных сывороток подавлять инфекционные свойства вируса в чувствительных к нему моделях. В результате этого вирус утрачивает способность размножаться и вызывать поддающиеся учету изменения в чувствительной к нему биологической системе (культура клеток, развирающийся куриный эмбрион, организм восприимчивого лабораторного животного).

Достоинствами реакции нейтрализации являются ее универсальность и высокая специфичность. К недостаткам ее относятся: высокая трудоемкость, необходимость строгого соблюдения стерильности материалов и инструментов, высокая стоимость тест-объектов, необходимость проведения математических расчетов, относительная длительность при постановке реакции. На результаты РН, особенно на их достоверность и воспроизводимость, оказывают влияние ряд факторов: методика постановки реакции, способ и правильность ее учета, концентрация используемых сывороток и вирусов, метод разведения компонентов реакции и др. Вируснейтрализующие антитела накапливаются в организме в период выздоровления (реконвалесценции) и остаются в нем длительное время. Оптимальные сроки для обнаружения антител в каждом случае различны и зависят от особенностей иммунитета при той или иной инфекции. Например, при гриппе свиней максимальный титр вируснейтрализующих антител регистрируется между 14 и 27-м днями и снижается к 6 месяцам. При лейкозе

30