84. Серологические реакции (рга,рнга,рн,риф) и их использование в диагностике инфекционных болезней.

Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микро­организмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализу­ющем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о спе­цифичности взаимодействия комплекса антиген—антитело.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использова­нии эритроцитов (или латекса) с адсорбиро­ванными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соот­ветствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеива­ние и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка.

Компоненты. Для постанов­ки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавли­вают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Ад­сорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома.

Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микро­организмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества.

Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обла­дающие высокой адсорбирующей активностью.

Применение. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гор­мона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительнос­ти к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.

Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - метод выявления специфических Аг с помощью Ат, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. Клеток.

Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфек­ционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике.

85. Посев и инкубирование микроорганизмов. Чистая культура и методы ее выделения. Культуральный (бактериологический) метод исследования - совокупность методик, направленных на выделение и идентификацию чистых культур микроорганизмов (бактерий) с помощью культивирования на питательных средах.

Чистая культура - совокупность микроорганизмов одного вида.

Чаще всего чистую культуру получают путем отбора и культивирования изолированной колонии (потомство одной микробной клетки).

ЭТАПЫ МЕТОДА:

I. Забор материала для исследования.

II. Выделение чистой культуры и ее идентификация.

III. Заключение.

I. Забор материала для исследования

Вид исследуемого материала зависит от цели исследования (диагностика - от больного;

Эпиданализ - из внешней среды, продуктов питания, больного и/или бактерионосителя).

II. Выделение чистой культуры включает 3 или 4 этапа

1. Посев материала (после предварительной микроскопии) на чашку с плотной питательной средой (лучше дифференциально-диагностической или селективной) с целью получения изолированных колоний. Посев производят чаще всего методом механического разобщения. В некоторых случаях (например, кровь) материал предварительно засевают в жидкую среду обогащения, с последующим пересевом на чашку с агаровой средой. Иногда до посева проводят селективную обработку материала (с учетом свойств выделяемого микроорганизма; например, обработка кислотой или щелочью для выделения устойчивых бактерий). Культивируют чаще всего при 37 50 0C 18-24 часа . Время культивирования для разных видов бактерий может колебаться.

2(3):

А) Изучение колоний на чашке с агаром по культуральным признакам, отбор наиболее типичных;

Б) Приготовление мазков из этих колоний с окраской (по Граму или другими методами);

В) Отсев остатка исследованной колонии на среду накопления и выращивание в термостате при оптимальной температуре.

3(4). Изучение чистоты культуры, полученной на среде накопления. С этой целью готовят мазок, окрашивают (чаще по Граму), микроскопически изучают морфологическую и тинкториальную однородность (в разных полях зрения). 4(5). Идентификация чистой культуры.

III. Заключение

По совокупности признаков в сравнении со свойствами эталонных (типовых) штаммов указывается вид выделенного из материала микроорганизма.

Оценка метода: 

Достоинства: относительно высокая чувствительность и точность, возможность определить численность микробов в исследуемом материале, а также чувствительность к антибиотикам.

Недостатки: относительная длительность, метод дорогостоящий.

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ

Метод механического разобщения микроорганизмов.

А) Посев материала на чашки Петри шпателем или петлей (см. Практикум).

Б) Посев пластинчатыми разводками - делают в пробирках десятикратные разведения материала в расплавленном и остуженном до 45 5о 0С МПА, а затем выливают содержимое пробирок в стерильные чашки Петри, дают агару застыть и инкубируют чашки в термостате.

В) Разобщение на основе подвижности микробов. Материал засевают в каплю конденсационной жидкости скошенного МПА. При этом подвижные микробы как бы «мигрируют» вверх по агаровому скосу и вырастают в виде колоний, расположенных в верхней части агара. При 2-3-кратном пассировании этих колоний в конденсационную жидкость скошенного агара удается получить чистую культуру подвижного микроба (например, протея).

Г) Разобщение на основе различий в размерах микроорганизмов. Для этого смесь микроорганизмов фильтруют через микро- и миллипористые фильтры. Чистые культуры получают, как правило, в фильтрах. Этот метод используют для получения чистых культур вирусов и микоплазм.

Метод заражения чувствительных лабораторных животных (биологический).

Основан на избирательной чувствительности организма животного к микробам различных видов, что выражается в быстрой скорости размножения определенного вида при попадании его в кровь и внутренние органы, откуда его и выделяют. В то же время другие виды микробов погибают под действием защитных факторов организма. Таким образом выделяют, например, чистую культуру пневмококков из организма белой мыши, палочки туляремии из организма морской свинки.

Методы, основанные на избирательной чувствительности микроорганизмов к воздействию внешних факторов.

А) Температуры: спорообразующие микробы выживают при нагревании смеси микробов, в то время, как неспорообразующие - гибнут.

Б) Кислот: при обработке смесей кислотоустойчивых и неустойчивых к кислотам микробов, последние гибнут, а кислотоустойчивые остаются, как правило, в чистой культуре. Так выделяют возбудителя туберкулеза.

В) Антибиотиков: основан на избирательной чувствительности определенных видов микробов к отдельным антибиотикам. При посеве смеси микробов на среду с добавлением антибиотика, вырастают нечувствительные к нему микробы.

Г) Анаэробных условий: дает возможность отделить группу анаэробных микроорганизмов от облигатных аэробов.