Глава 4. Основы клеточной возбудимости |
75 |
«внутренняя сторона снаружи», когда с раствором в пипетке контактирует внешняя сторона мембраны; возможна также конфигурация outside-out-patch — «наружная сторона снаружи», когда с содержимым пипетки контактирует внутренняя сторона мембраны. Если во фрагменте мембраны находится только один функционирующий канал, то с помощью метода фиксации потенциала можно исследовать его свойства.
Коротко
Структура ионных каналов
Ионные каналы — интегральные мембранные белки, которые образуют заполненную водой пору, обеспечивая проникновение ионов через липидный бислой мембраны. Движущей силой для диффузии ионов через пору является электрохимический градиент, который складывается из градиента концентрации (химическая движущая сила) и разности потенциалов (электрическая движущая сила).
Селективность ионных каналов
Ионные каналы проявляют более или менее выраженную селективность в отношении проходящих через них ионов. Существует две основные группы каналов: катионные (различаются в зависимости от природы пропускаемых ими катионов) и анионные.
Функциональные характеристики каналообразующих белков (за исключением селективности) определяются особенностями работы их воротного механизма. В результате конформационных изменений канал может переключаться между открытым и закрытым состояниями, причем в открытом состоянии пора канала проницаема для ионов.
Поток ионов через канал зависит от вероятности его открывания и амплитуды тока через него.
4.2. Структура потенциалуправляемых катионных каналов
Топология и структурная организация
!Ионные каналы состоят из порообразующих α-субъединиц и дополнительных β-субъединиц; структура белка-каналоформера определена аминокислотной последовательностью и мембранной топологией этих компонентов.
Мембранная топология. Аминокислотная последовательность (первичная структура) белка-ка-
Рис. 4.5. Первичная последовательность белка и топология мембраны. Топологии мембраны белков двух калиевых каналов построены на основании «профиля гидропатии» их аминокислотной последовательности. В верхней части рисунка представлены профили гидропатии двухсегментного (А) и шестисегментного (Б) канала по отношению к соответствующей первичной структуре белка: кривые для аминокислот с гидрофобным показателем направлены от средней линии вверх, кривые для аминокислот с гидрофильным показателем — вниз. Помечены (желтым) гидрофобные сегменты, длина которых достаточна, чтобы пройти клеточную мембрану насквозь в виде α-спирали. На нижней половине рисунка показаны топологии
каналов, основанные на профиле гидропатии: один канал имеет два, другой — шесть трансмембранных доменов с внутриклеточными N- и C-концами. Гидрофобный сегмент между двумя трансмембранными доменами (помеченными желтым) участвует в образовании поры канала и называется поровой петлей (Р-петля, или Р-домен)
76 I. Общая физиология клетки
налоформера содержит гидрофобные и гидрофильные участки (рис. 4.5). От них зависит размещение белка в клеточной мембране (мембранная топология) и в итоге — характер сворачивания белковой молекулы, т. е. его третичная структура.
Гидрофобные участки (в основном вторичные структуры) обычно имеют конфигурацию α-спиралей, пронизывающих липидный бислой
клеточной мембраны.
Гидрофильные участки, в том числе N- и C-концевые участки полипептидов, находятся в водной среде внутриклеточного и внеклеточного пространств либо поры, проводящей ионы (рис. 4.5).
Количество гидрофобных и гидрофильных участков может быть разным, причем эволюционно
Рис. 4.6. Строение двухсегментного калиевого канала, представленное на основе данных кристаллографии. А. Вид сбоку и сверху. Б. Две противолежащие субъединицы. Показана структура канала из четырех субъединиц, симметрично расположенных вокруг центральной поры. Селективный фильтр (в нем находятся три иона K+) образован Р-спиралью
иС-концом Р-петли; трансмембранные сегменты S1
иS2 представляют собой α-спирали, расположенные
друг за другом. Цитоплазматический вход в пору построен из N- и С-концов четырех субъединиц
более древними являются, видимо, формы с двумя или шестью трансмембранными сегментами (двухили шестисегментные каналы).
Структура поры ионного канала. Порообразующий белок двухили шестисегментного канала — это единая молекула из нескольких полипептидов (четвертичная структура). Методом рентгеноструктурного анализа кристаллизованного белка была изучена атомная структура относительно простого двухсегментного калиевого канала (рис. 4.6).
Этот калиевый канал представляет собой тетрамер; четыре его субъединицы располагаются вдоль оси симметрии белка, окружая пору. Со стороны цитоплазмы стенка поры образована С-концом трансмембранной спирали (внутренней спирали S2), а с внеклеточной стороны — соединительным доменом (Р-петлей, или Р-доменом) двух трансмембранных сегментов (рис. 4.5). Молекула канала отделена от липидного матрикса N-концом трансмембранной спирали (наружной спирали S1), которая располагается за внутренней спиралью и слегка наклонена по отношению к ней. С цитоплазматической стороны устье поры образуют N- и C-концы четырех субъединиц канала (рис. 4.6).
Селективный фильтр. Селективный фильтр K+-канала — самый узкий участок поры, который находится недалеко от наружного устья; он образован С-концом Р-петли и стабилизирован короткой спиралью поры (рис. 4.7). В K+-канале любого типа стенка селективного фильтра содержит характерную последовательность аминокислот (гли- цин—тирозин—глицин; GTG-мотив); ее особенность в том, что карбоксильные группы остатков тирозина и внутренних остатков глицина четырех субъединиц каналоформера образуют кольцевую структуру (рис. 4.1), идеально заменяющую гидратную оболочку для K+, но не для Na+ или Li+. Такой
«заместитель гидратной оболочки» обеспечивает высокую селективность K+-канала, т. е. его способность пропускать более крупные ионы K+ (радиус 1,33 А), но не мелкие ионы Na+ (радиусом 0,95 А) или Li+ (радиусом 0,6 А) (рис. 4.7).
Структурные основы проницаемости и селективности калиевого канала. Рентгеноструктурное исследование кристаллов двухсегментного K+-канала показало, что вследствие сниженного барьера Борна в этом канале возможен более значительный поток ионов. Прежде всего здесь очень короткий селективный фильтр, так что внутриклеточная среда практически соприкасается с внеклеточной и энергия, необходимая для проникновения иона, уменьшается до минимума. Кроме того, при электростатическом взаимодействии между атомом кислорода карбоксильной группы и ионом высвобождается дополнительная энергия для перехода иона через мембрану (рис. 4.7). Другую важную особенность структуры канала составляет дипольный момент спиралей поры, обусловленный неравным распределением заряда α-спиралей: благодаря осо-
бому расположению вокруг поры четырех спиралей возникает отрицательный потенциал в селективном фильтре, способствующий входу катионов и выталкиванию анионов.
|
|
Глава 4. Основы клеточной возбудимости |
77 |
|
Классификация катионных каналов |
Что касается четырех дополнительных транс- |
|||
|
|
мембранных сегментов, то обнаружена следующая |
||
|
|
|||
В зависимости от аминокислотной последователь- |
особенность первичной структуры самой последней |
|||
! ности и мембранной топологии катионные каналы |
спирали S4: каждая третья позиция внутри этой |
|||
подразделяются на классы, семейства и подсе- |
спирали занята положительно заряженной амино- |
|||
мейства. |
кислотой — аргинином или лизином, так что сег- |
|||
|
|
|||
|
|
мент S4 при физиологическом уровне рН получает |
||
Классы каналов. Порообразующая субъеди- |
положительный заряд. Сегмент S4 служит в ка- |
|||
ница большинства ионных каналов либо состоит |
налах «сенсором» — детектором изменений мем- |
|||
из двух последовательных трансмембранных сег- |
бранного потенциала; этот механизм присутствует |
|||
ментов, соединенных Р-доменами, либо представ- |
во всех потенциалуправляемых ионных каналах |
|||
ляет собой аналогичную структуру. Гены известных |
(см. далее). |
|
||
каналов принято подразделять исходя из количе- |
С точки зрения модульного принципа кана- |
|||
ства подобных структур, а также числа и свойств |
лы других классов можно рассматривать как объ- |
|||
прочих трансмембранных сегментов (рис. 4.8). |
единения двух- и шестисегментных субъединиц |
|||
Наиболее простое эволюционное расширение |
(рис. 4.8). Следовательно, калиевые каналы с дву- |
|||
структуры двухсегментного канала — это шестисег- |
мя Р-доменами являются системой из двух двух- |
|||
ментный канал. В пределах этого класса каналов |
сегментных субъединиц, а потенциалуправляемые |
|||
выделено более 90 (!) различных генов. |
натриевые и кальциевые каналы (NаV- и CaV-ка- |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Рис. 4.7. Функция селективного фильтра калиевого канала. А. Вид поры сбоку (для упрощения представлены только две субъединицы). В селективном фильтре видны четыре участка связывания с K+ (в виде глобул), причем два участка могут быть заняты одновременно (в конфигурациях 1–3 или 2–4). Б. Позиционирование иона K+ определяется его взаимодействием с карбонилоксидами аминокислот тирозина (Tyr, Y), глицина (Gly, G), валина (Val, V) и треонина (Thr, T) селективного фильтра (GYG-мотив). В. Карбонилоксиды замещают водную оболочку K+, поскольку энергия, высвобождаемая при связывании K+ в селективном фильтре, больше, чем энергия, необходимая для дегидратации иона K+
78 I. Общая физиология клетки
Рис. 4.8. Архитектура и топология белков, образующих катионные каналы. Основу «древовидной» структуры ионных каналов составляют разнообразные комбинации двух- и шестисегментных субъединиц. Ген потенциалзависимых NаV- и CaV-каналов кодирует четыре шестисегментные субъединицы; соответственно классификация CaV-каналов включает в себя несколько типов: L-, P/Q-, N-, R- и T. Калиевые каналы с двумя Р-доменами, состоящие из двух двухсегментных субъединиц, в основном являются «фоновыми» каналами нейронов. К классу двухсегментных каналов относятся K+ir-каналы внутреннего выпрямления, эпителиальные Na-каналы и протон-активируемые каналы (ASIC). В класс (или семейство) шестисегментных каналов входят потенциалзависимые K+-каналы (КV), Ca2+-управляемые калиевые каналы (КСа); катионные каналы, активируемые гиперполяризацией (HCN); каналы, управляемые циклическими нуклеотидами (CNG), и катионные каналы TRP-типа, управляемые различными посредниками. Некоторые из перечисленных семейств каналов можно дополнительно разделить на подгруппы
налы) — объединения из четырех шестисегментных субъединиц. Подобная система из четырех объединенных шестисегментных субъединиц, кодируемая одним геном, соответствует альтернативному принципу формирования структуры NаV- и CaV-ка- налов; в то время как двух-, четырех- и шестисегментные каналы построены из четырех субъединиц по «принципу 4 × 1», молекулы NаV- и CaV-кана-
лов образованы одной субъединицей по «принципу 1 × 4».
Семейства и подсемейства каналов. На основе сходства аминокислотных последовательностей каналы можно разделить на семейства и подсемейства (рис. 4.8). Примеры семейств — потенциалуправляемые калиевые каналы (КV), кальцийуправляемые калиевые каналы (КСа), калиевые каналы внутреннего выпрямления (Кir); примеры подсемейств — КV1-, SК-, а также Кir-2-кана- лы. Подобное подразделение играет важную роль в развитии представлений об архитектуре каналов,
поскольку двух- и шестисегментные каналы необязательно должны включать в себя четыре идентичные субъединицы (такие объединения называются гомомерами), но могут также быть гетеромерами, т. е. состоять из различных молекул. Однако гетеромультимерность возможна только в пределах α-субъединиц одного подсемейства, но не среди
представителей различных семейств или классов ионных каналов.
Представленная классификация генов, кодирующих каналы различного типа, учитывает прежде всего структуру и основные функциональные характеристики каналов. Физиологические свойства обобщены в табл. А2 (см. Приложение) и более подробно описаны в главах, посвященных тканям и органам, где функционирует соответствующий каналообразующий белок.
Дополнительные субъединицы. Наряду с перечисленными порообразующими субъединицами многие каналы содержат ассоциированные белки,