Глава 5. Методы выявления и оценки генотоксикантов

5.3.4. Статистическая обработка результатов

Поскольку работа проводится как индивидуальное и групповое исследование, обработке и анализу подвергаются данные, полученные всеми студентами группы. На основании всех таблиц, составленных группой, составляется общая таблица, куда заносятся данные всех студентов.

Статистическая обработка результатов проводится аналогично таковой при использовании хлореллы в качестве тест-объекта.

Рассчитайте значение X ± m для митотического индекса в

контрольном опытном вариантах. Определите достоверность разницы между контрольным и опытным вариантом с использованием t-критерия Стьюдента.

Сделайте вывод о митотоксическом действии изучаемого фактора на основе статистически обработанных результатов опыта.

Представьте в виде диаграммы полученные результаты

(рис. 5.3.4).

Рис. 5.3.4. Митотический индекс

в меристеме проростков корешков Allium cepa

Определение относительной длительности фаз митоза

Если значение митотического индекса в опытном варианте ниже, чем в контрольном, делается заключение о митотоксическом действии фактора. Если значение митотического индекса в опытном варианте превышает контрольное, то однозначного вывода сделать нельзя.

Увеличение МI может быть обусловлено как усилением пролиферации клеток, так и изменением продолжительности различных фаз, то есть задержкой клеток на определенных фазах мито-

81

Генетическая токсикология

за. Вскрыть причины изменения МI можно, анализируя продолжительность фазных индексов.

Фазные индексы позволяют судить об относительной длительности каждой фазы митоза. Определяют относительные длительности фаз митоза по следующей формуле:

где П, М – количество клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы и т.д.

Рассчитайте фазные индексы для опытного и контрольного корешков. Данные занесите в таблицу 5.3.2. Рассчитайте средние значения для величин фазных индексов (ПИ, МИ, АИ, ТИ) контрольного и опытного вариантов. Представьте полученные данные графически (рис. 5.3.5). Проведите сравнение относительной длительности разных фаз митоза в контроле и опыте.

Рис. 5.3.5. Соотношение фазных индексов

На основании этого сравнения можно сделать предположение о характере действия изучаемого фактора на митоз.

Например, если в опытном варианте отмечено увеличение МI, при этом значение АИ и ТИ снижено, а значение МИ увеличено. Такая ситуация в ткани может быть вызвана действием анализируемого фактора на веретено деления в меристематических

82

Глава 5. Методы выявления и оценки генотоксикантов

клетках. В этом случае расхождение хромосом к полюсам, обеспечиваемое ахроматиновым веретеном, происходить не будет. Клетка не может пройти из метафазы в анафазу, следствием этого могут быть геномные мутации. Если снижен ПИ, можно предположить, что данный фактор влияет на процессы, происходящие в интерфазу при подготовке клеток к делению. Увеличение ПИ по сравнению с контролем свидетельствует о том, что затруднено прохождение клетками стадии профазы, что может быть вызвано нарушением надмолекулярной структуры хромосом. Таким образом, определение МI позволяет регистрировать митотоксическое действие вещества, а расчеты ФИ помогают выявить механизм этого действия.

5.4 Определение мутагенного действия факторов окружающей среды

сиспользованием Allium cepa

вкачестве тест-объекта

Изучение митотически делящихся тканей позволяет оценивать мутагенное действие факторов окружающей среды окружающей среды по способности вызывать хромосомные перестройки (аберрации).

Аберрации хромосом (ХА), то есть изменения структуры хромосом, изучаются на стадии метафазы (метафазный метод) и на стадии ана-телофазы (анателофазный метод). Эти методы позволяют выявлять мутагенную активность того или иного фактора, оценить степень мутагенной активности фактора, силу воздействия разных его доз, определять минимальную действующую дозу, определять зависимость доза-эффект.

Наиболее точным является метафазный метод, так как он регистрирует большее количество типов аберраций, определяет тип перестройки и в какой именно хромосоме она произошла. Но этот метод пригоден только для объектов, для которых уже идентифицированы все хромосомы, определен кариотип. Метафазный анализ более сложный и требует высокой квалификации исследователя. Этот метод используется, например, для диагностики хромосомных болезней человека.

83

Генетическая токсикология

Ана-телофазный анализ более простой, экономичный, не требует знания кариотипа и идентификации типов повреждения хромосом. Он позволяет выявить меньше типов аберраций, но его чувствительность вполне достаточна для заключения «мутагенен» или «немутагенен» фактор. Ана-телофазный анализ является достаточно чувствительным, корректным и удобным на первом экотоксикогенетического исследования.

5.4.1.Типы хромосомных аберраций, выявляемые ана-телофазным методом

Структурные изменения хромосом связаны с разрывом и воссоединением частей хромосом.

Структурные изменения отличаются друг от друга в зависимости от того, на какой стадии митотического цикла произошло нарушение. Если нарушение прошло на стадии G1, то есть до р е- дупликации хромосом, наблюдаются хромосомные разрывы. Если хромосома уже редуплицирована и имеет две хроматиды (ста-

дия S или G2), происходят хроматидные разрывы.

Анна-телофазный метод позволяет выявлять следующие типы структурных перестроек хромосом (рис. 5.4.1).

Делеция – потеря участка хромосомы, возникновение центрических (с центромерой) и ацентрических (без центромеры) фрагментов.

Концевая делеция – потеря концевого участка хромосомы. В случае хромосомной делеции наблюдаются два фрагмента, лежащие параллельно друг другу, в случае хроматидной делеции имеется одиночный фрагмент. Если имеется изохроматидная делеция, т.е. повреждены концы обеих хроматид, то пару хроматидных фрагментов трудно отличить от двойных хромосомных фрагментов.

Интерстициальная делеция – потеря внутреннего участка хромосомы. При потере внутреннего участка одного плеча (парацентрическая делеция) образуются кольцевые ацентрические фрагменты и микрофрагменты. При перицентрической делеции, включающей центромерный район, образуется центрическое кольцо. В случае хромосомной делеции такое кольцо будет двойным с расположенными рядом двумя фрагментами, в случае хро-

84