ГЛАВА 3. Методы оценки мутагенов

3.4. Цитогенетические методы

Главным недостатком низших организмов как объектов генетической токсикологии является сложность экстраполяции полученных данных на человека из-за различия в процессах метаболической активации. Таким образом, выявление косвенных мутагенов в этих тестах может быть некорректным. Поэтому в генетической токсикологии разработаны методы с использованием млекопитающих in vivо или in vitro. Наиболее широко используются цитогенетические методы, характеризующие действие фактора по частоте хромосомных мутаций. Из них наиболее часто применяются метафазный анализ, ана-телофазный анализ, микроядерный тест и метод сестринских хроматидных обменов (СХО).

3.4.1. Метафазный анализ

Анализ хромосом соматических клеток в метафазу митоза методически хорошо разработан. Метод информативен, так как:

–кариотип многих организмов хорошо изучен,

–в метафазу виден весь геном целиком непосредственно с помощью микроскопического анализа,

–метод достаточно краткосрочен и экономичен,

–в метафазу хромосомы хорошо видны.

Метафазный анализ проводится в митотически делящихся клетках человека и высших животных. В генетической токсикологии особенно широко используется культура лейкоцитов периферической крови человека.

Метафазный анализ является обязательным компонентом систем, предназначенных для проверки факторов внешней среды на мутагенную активность.

Принцип метода

Для целей тестирования используют микроили полумикрометод.

Периферическую кровь человека помещают в питательную среду, содержащую все необходимое для жизни и размножения клеток вне организма. В культуру добавляют стимулятор митозов фитогемагглютинин (ФГА). В результате лейкоциты вступают в

47

Генетическая токсикология

митозы. Далее культуру подвергают воздействию изучаемого фактора. Клетки инкубируют при 37° в течение 72 часов. За 6 часов до конца инкубации в культуру добавляется колхицин или кальцимид, которые препятствуют образованию ахроматинового веретена деления и способствуют спирализации хромосом. В результате деление клетки останавливается на стадии метафазы. Это приводит к накоплению метафазных клеток в культуре. Через 72 часа инкубации культуру центрифугируют. Осевшие на дно пробирки клетки обрабатывают гипотоническим раствором хлористого калия или цитрата натрия. Это приводит к набуханию клеток и облегчает разброс хромосом на цитологическом препарате. Затем гипотонический раствор убирают центрифугированием, клетки фиксируют (фиксатор: 3 части метилового спирта и 1 часть ледяной уксусной кислоты). Взвесь клеток наносят на предметное стекло, выжигают фиксатор. Препарат окрашивают. Для генотоксических исследований используется так называемое равномерное окрашивание по Романовскому – Гимза.

После окраски препараты исследуют под микроскопом при увеличении 12,5 × 1,5 × 100. Выбирают метафазные пластинки, отвечающие следующим требованиям:

–метафазные пластинки не должны иметь большого количества наложений хромосом;

–уровень спирализации должен быть таким, чтобы акроцентрические хромосомы были видны в виде четко выраженных структур;

–не анализируются метафазные пластинки с хромосомами, входящими в анафазу;

–учитываются клетки с числом хромосом от 44 до 47, так как из-за технических манипуляций возможны потери хромосом в пластинке.

Для генотоксического анализа не требуется проведение кариотипирования, о мутагенной активности судят по частоте хромосомных аберраций. Определяют: общее число проанализированных клеток, количество клеток с аберрациями хромосом, общее число поврежденных хромосом и типы аберраций. О мутагенности фактора судят, сравнивая эти показатели в контрольном и опытном вариантах.

48