1 курс / Химия / Kharitonov_Yu_Ya_-_Analiticheskaya_khimia_2_chast

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

Рис. 9.6. Масс-спектры некоторых примесей технического витамина Е (m/z — отношение массы т к зарядуг; г = 1); / — относительная интенсивность.

/ — изофитол, 2 — дигидроизофигол, 3 — диацетат димера триметилгидрохинона СггНгг.Ог,, 4— 2,6,10,13,16,20-гексаметилтриэйкозан, 5—3,7,11,15-тетраметилгексадекандиол-1,3

9.2.6. Применение газожидкостной хроматографии

Методы ГЖХ используются для разделения различных смесей, в том числе оптических изомеров, идентификации веществ, их количественно­ го определения.

В фармакопейном анализе ГЖХ используют при контроле качества субстанций и лекарственных форм — чаще всего для идентификации и определения остаточных летучих растворителей, следы которых сохра­ няются в препаратах при их получении. Так, например, определяют аце­ тон и метанол в пилокарпина и сотанола гидрохлоридах, в спиробромине, метанол — в пирацетаме, этанол — в калгеле и мелоксикаме, изопропа­ нол — в амиодароне, флуконазоле, примеси в камфоре, бромкамфоре, этиловом эфире а-бромизовалериановой кислоты, в препаратах витамина £ и во многих других лекарственных субстанциях и формах.

Методами высокоэффективной капиллярной ГЖХ определяют ме­ таболические профили биологических сред — крови, мочи, слюны. Хро-

431

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

матограммы таких сложных объек­ тов имеют многие десятки пиков компонентов, причем не всегда известно, к какому веществу отно­ сится тот или иной пик. Поэтому для характеристики состояния сре­ ды используют всю хроматограмму в целом — ее профиль — хромато­ графический метаболический про­ филь, характерный для определенно­ го состояния биологической среды.

Профиль хроматограмм —

совокупность данных о числе, от­ носительном расположении, ин­ тенсивности и форме пиков, воспринимаемая как единый образ, характе­

ризующий природу, происхождение и особенности состава анализируе­ мой многокомпонентной смеси. Профиль хроматограммы получают при проведении только одного анализа, все вещества хроматографируются в идентичных условиях, что позволяет оценить содержание каждого компо­ нента.

В качестве примера на рис. 9.7 приведены хроматографические сте­ роидные профили мочи здорового (а) и больного (б) человека. Эти про­ фили различны.

По характеру профиля можно судить об особенностях и эффектив­ ности лечения того или иного заболевания.

Хроматографические профили могут быть использованы для заклю­ чений о специфике или аналогии различных объектов, содержащих большое число составных компонентов.

9.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография

Несмотря на большие достоинства методов ГЖХ, они неприменимы для разделения и определения веществ с высокой молярной массой (больше -300), нелетучих, термически нестойких, ионогенных соедине­ ний. Эти недостатки отсутствуют в методе высокоэффективной жидкост­ ной хроматографии — ВЭЖХ.

Высокоэффективная жидкостная хроматография, или жидкостная хроматография высокого давления, основана ha тех же принципах, что и ГЖХ, только вместо газа-носителя в качестве ПФ применяется поток жидкости, не смешивающейся с жидкой НФ хроматографической колон­ ки. Таким образом, в ВЭЖХ обе контактирующие фазы — НФ и ПФ —

432

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

гать -2000. На рис. 9.8 показана принципиальная блок-схема жидкостно­ го хроматографа.

Резервуар 1 для растворителя из нержавеющей стали или другого материала может иметь в аналитическом варианте объем около 1 л. Насос 2 служит для подачи жидкой фазы из резервуара 1 под повышенным давлени­ ем. Он обеспечивает подачу жидкости со скоростью до 10 мл/мин при высо­ ком давлении на входе в колонку — до 100—500 атм. Между насосом и ко­ лонкой устанавливается фильтр с диаметром пор около ~10 мкм.

В микроколоночных жидкостных хроматографах применяют насос низкого давления — до 10—20 атм.

Для ввода анализируемой пробы служит устройство 3. При давлении жидкости, превышающем -120 атм, ввод пробы шприцем затруднителен, поэтому используют специальные многоходовые краны. Объем вводимой пробы может составлять 0,05—50 мкг.

Аналитическую хроматографическую колонку 4 обычно делают из нержавеющей стали или стекла толстостенной, длиной -10—25 см (мо­ жет быть и больше), с внутренним диаметром 3—8 мм. Предпочтительны прямые колонки.

В микроколоночных жидкостных хроматографах применяют колон­ ки меньшей длины с внутренним диаметром 1—2 мм и даже меньше.

Устройство для ввода пробы и хроматографическая колонка нахо­ дятся в воздушном или водяном термостате 5, который поддерживает заданную температуру с точностью ±0,1 °С.

Рабочая температура термостатирования лежит между температурами замерзания и кипения жидкой ПФ, чаще всего — в диапазоне от 20 до 50 °С.

Система 6 включает детектор специального типа. Применяют спек­ трофотометрические (с постоянной или переменной длиной волны), реф­ рактометрические, адсорбционно-термометрические, флуориметрические детекторы и некоторые другие.

Детекторы бывают двух типов. Детекторы первого типа реагируют на изменение свойств растворителя (например, показателя преломления). Детекторы второго типа реагируют на свойства растворенного вещества,

433

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

например, спектрофотометрические детекторы, обладающие высокой чувствительностью и селективностью.

Сигнал от. детектора преобразуется, усиливается и регистрируется самописцем на бумаге в виде хроматограммы, аналогичной хромато­ грамме в ГЖХ.

Используют наполненные хроматографические колонки, которые заполняют частицами твердого носителя с нанесенной на их поверхность тонкой пленкой жидкой ПФ. Размер зерен твердого носителя составляет 5— 10 мкм. Твердый носитель готовят из поверхностно-пористых мате­ риалов — силикагеля с гидроксилированной поверхностью или с приви­ тыми на поверхности различными функциональными группами; алюмо­ гель, пористые стекла, полимерные сорбенты.

Заполнение колонок проводится под высоким давлением, поэтому упаковка частиц внутри колонки получается плотной, что способствует высокоэффективному разделению компонентов смеси.

Жидкая НФ, наносимая на поверхность частиц твердого носителя, составляет 0,75— 1,5% от массы твердого носителя.

Обычно для разделения полярных веществ используют полярные же НФ и относительно малополярные ПФ. Неполярные вещества разделяют на неполярных же НФ — применением полярных ПФ.

В качестве жидких НФ используют различные вещества, например: $,$'-оксипропионитрил — для разделения фенолов, пероксидов, аро­

матических аминов, спиртов, а также углеводов, алкалоидов, стероидов; ПФ — циклопентан, гексан, гептан, хлороформ;

триэтшенгликоль — селективен по отношению к разделению спир­ тов, пероксидов, соединений с ОН-группами; ПФ — та же;

цианоэтилсиликон — для разделения сульфамидных производных, замещенных аминов и др.; ПФ — тетрагидрофуран, изопропанол.

Жидкие НФ несколько, хотя и незначительно, растворяются в ПФ и частично уносятся с ней. При повышенных скоростях движения ПФ ме­ ханический унос жидкой НФ может стать заметным. Поэтому применяют ПФ, химически связанные с поверхностью частиц твердого носителя, например, твердые носители с химически связанными кремнийорганическими полимерами.

ВВЭЖХ используют как нормально-фазовый,-так и обращенно-фа- зовый варианты. В первом случае полярность НФ больше полярности ПФ, во втором, наоборот, полярность НФ меньше полярности ПФ.

Вобращенно-фазовом варианте применяют твердый носитель из си­ ликагеля с привитыми гидрофобными группами. В этих случаях в каче­ стве ПФ используют смесь воды с низкомолекулярными спиртами или с ацетонитрилом.

ВЭЖХ очень широко применяется для идентификации, разделения и определения самых различных веществ: оптически активных соединений,

434

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

белков, нуклеиновых и аминокислот, полисахаридов, красителей, взрыв­ чатых веществ, биологических сред, лекарственных препаратов и т.д. Метод используют для проведения профильного хроматографического анализа медицинско-биологических объектов в случаях патологических ' отклонений от нормы — так называемый «метод распознавания образов».

При технологическом и фармакопейном контроле качества лекарст­ венных субстанций и лекарственных форм ВЭЖХ стала одним из основ­ ных методов определения как самих фармакологически активных ве­ ществ, так и вспомогательных компонентов и посторонних примесей.

Так, например, методом ВЭЖХ анализируют лекарственные препа­ раты альдактон, амизол, вальпроат натрия, глиборал, диклофенак натрия, козаар, кофеин, лидокаина гидрохлорид, мелоксикам, месалазин, параце­ тамол, пилокарпина гидрохлорид, пирацетам, соталола и цетилпиридина гидрохлориды, флуконазол и многие другие.

9.4.Примеры и задачи к гл. 9

9.4.1.Примеры

1.Разделение меди(Н) и железа(Ш) методом ионообменной хрома­ тографии с последующим титриметрическим определением меди и фо­ тометрическим определением железа. Медь(Н) и железо(Ш), совместно присутствующие в водном растворе, можно разделить на катионообменнике (например, на катионите КУ-2). Предварительно катионйт, которым заполнена хроматографическая колонка, переводят в Н-форму, пропуская через колонку раствор 1 моль/л НС1. При этом все катионы, которые мог­ ли присутствовать в сорбенте, обмениваются на ионы Н+, переходят в раствор и уносятся с ним из колонки. После этого через колонку пропус­ кают дистиллированную воду.

Для разделения меди(Н) и железа(Ш) их переводят в комплексные соединения с противоположными знаками зарядов, прибавляя в анализи­ руемый раствор сульфосалициловую кислоту и аммиак. В этих условиях медь(Н) образует положительно заряженный комплекс [Cu(NH3)4]2+, а железо(Ш) — отрицательно заряженный сульфосалицилатный комплекс, состав и заряд которого зависят от концентрации прибавленной сульфосалициловой кислоты и pH среды. Обычно считается, что в условиях проведения анализа образуется трисульфосалицилатный (три аниона сульфосалициловой кислоты связаны с одним атомом железа(Ш)) анион­ ный комплекс железа(Ш) желтого цвета с максимумом в спектре погло­ щения около 416 нм.

435

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

При пропускании полученного раствора через колонку с катионитом

вН-форме катионы [Cu(NH3)4]2+ сорбируются на катионите, тогда как отрицательно заряженные сульфосалицилатные комплексы железа(Ш) на катионите не сорбируются и уносятся с ПФ, которую собирают в мерной колбе. После этого через колонку несколько раз пропускают смесь рас­ творов сульфосалициловой кислоты и аммиака, собирают элюат в ту же мерную колбу, которую затем доводят до метки дистиллированной водой, и получают раствор желтого цвета, содержащий все исходное железо(Ш).

Медь(И) затем элюируют из колонки раствором НС1, собирая элюат

вдругую мерную колбу. Для этого через колонку с катионитом, содер­ жащим медь(Н), пропускают 4 моль/л раствор НС1, после чего колонку несколько раз промывают дистиллированной водой до отрицательной ре­ акции на медь(П). Аммиачный комплекс меди(Н) разрушается, и медь(Н) элюируется уже в форме хлоридных комплексов.

Элюат и промывные воды, собранные в мерной колбе, доводят дис­ тиллированной водой до метки и получают раствор, содержащий всю отделенную медь(Н).

Содержание меди(Н) в растворе определяют иодометрическим тит­ рованием. Для этого к аликвотной части раствора, содержащего медь(Н), прибавляют избыток 10%-ного раствора KI и оставляют смесь на не­ сколько минут. Протекает реакция

2 C U2+ + 21“ = 2Cu++ l2

Образовавшийся иод оттитровывают стандартным раствором тио­ сульфата натрия в присутствии индикатора — крахмала до исчезновения синей окраски титруемого раствора:

I2 + 2Na2S20 3 = 2NaI + Na2S40 6

Определение железа(Ш) можно провести фотометрически, напри­ мер, на фотоэлектроколориметре с использованием светофильтра с мак­ симумом светопоглощения около 400 нм, измеряя оптическую плотность анализируемого раствора относительно раствора сравнения — дистилли­ рованной воды.

Методика проведения анализа. 1) Подготовка хроматографичес­ кой колонки. Колонку (стеклянную бюретку с краном или затвором вни­ зу) заполняют катионитом КУ-2 в Н-форме. Через колонку пропускают 20 мл 1 моль/л раствора HCI со скоростью вытекания элюата 1—2 мл в минуту. Затем через колонку пропускают с той же скоростью не менее 20 мл дистиллированной воды. Необходимо следить за тем, чтобы над катиони­ том всегда был слой жидкости высотой 1—2 см.

2) Разделение меди(П) и железа(Ш). К анализируемому раствору

ной сульфосалициловой кислоты, 10 мл 10%-ного раствора аммиака. Рас-

436

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

твор окрашивается в темно-зеленый цвет. Полученный раствор количе­ ственно пропускают через колонку со скоростью вытекания элюата 1—2 капли в секунду. Первые -10 мл элюата, не содержащего железа(Ш), со­ бирают в градуированную пробирку и отбрасывают. Далее весь элюат собирают в мерную колбу на 50 мл. Для того чтобы весь анализируемый раствор был перенесен в колонку, стакан дважды обмывают смесью, со­ стоящей из 2 мл раствора сульфосалициловой кислоты и 2 мл раствора аммиака, каждый раз количественно сливая раствор в колонку.

Затем колонку трижды последовательно промывают элюэнтами, со­ стоящими из следующих смесей:

а) 5 мл раствора сульфосалициловой кислоты и 5 мл раствора ам­ миака;

б) 3 мл раствора сульфосалициловой кислоты, 3 мл раствора аммиа­ ка и 2 мл воды;

в) 1 мл раствора сульфосалициловой кислоты, I мл раствора аммиа­ ка и 6 мл воды.

При промывании колонки этими растворами поддерживают посто­ янной скорость вытекания элюата — 1—2 капли в секунду. Объем рас­ твора, собранного в мерной колбе на 50 мл, доводят до метки дистилли­ рованной водой и перемешивают.

Медь(Н) из катионита элюируют раствором НС1 и собирают элюат в другую мерную колбу на 50 мл. Для этого через колонку дважды пропус­ кают по 10 мл 4 моль/л раствора НС1 со скоростью вытекания элюата 1—2 капли в секунду. Затем через колонку пропускают дистиллирован­ ную воду порциями по 10 мл, собирая элюат в ту же мерную колбу, до отрицательной реакции элюата на присутствие в нем меди(И). Каплю элюата помещают на фильтровальную бумагу, пропитанную раствором K4[Fe(CN)6]. Красно-бурое окрашивание, характерное для ферроцианида меди, должно отсутствовать. В противном случае промывание продолжают.

Раствор, собранный в мерной колбе и содержащий всю элюирован­ ную медь(И), доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

3) Определение меди(П). В колбу для титрования отбирают пипеткой 2 мл раствора из мерной колбы, содержащей медь(Н), прибавляют 2 мл 10%- ного раствора иодида калия KI, накрывают колбу стеклом и оставляют в темном месте на -10 минут. Выделившийся иод титруют стандартным рас­ твором тиосульфата натрия до бледно-желтой окраски титруемого раствора, после чего прибавляют 0,5 мл свежеприготовленного раствора крахмала (титруемый раствор сразу синеет) и продолжают титровать до исчезновения синей окраски. Проводят 3—5 параллельных определений и рассчитывают массу меди(И) т(С.и) в исходном анализируемом растворе:

/j(Cu) = w(1/2l2) = «(Na2S20 3), c(Cu)K(Cu) = c(Na2S20 3)K(Na2S20 3),

437

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

с(Си) = c(Na2S2Q3)K(Na2S2Q3) К(Си)

т(Си) = с(Си)М(Си)Кк,

где л(Си), л(’/212) и w(Na2S20 3) — количество эквивалентов меди, иода и тиосульфата натрия соответственно; с(Си) и c(Na2S20 3) — молярная кон­ центрация меди в мерной колбе на 50 мл и стандартного раствора тио­ сульфата натрия соответственно; К(Си) = 2 мл = 0,002 л; K(Na2S20 3) — объем стандартного раствора тиосульфата натрия, израсходованный на титрование; М(Си) = 63,546 — молярная масса меди, VK= 50 мл = 0,050 л.

Массу меди рассчитывают в граммах с точностью до трех значащих цифр.

4) Определение железа(Ш) Собранный в мерной колбе на 50 мл рас­ твор сульфосалицилатных комплексов железа(Ш) фотометрируют на фо­ тоэлектроколориметре, например, на КФК-2, при светофильтре 400 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см относительно дистиллиро­ ванной воды (раствор сравнения).

Определение проводят по методу одного стандарта. Стандартный раствор сульфосалицилатных комплексов железа(Ш) готовят в мерной колбе на 50 мл. Для этого пипеткой вносят в колбу 2 мл раствора соли железа(Ш), содержащего 0,10 мг/мл железа(Ш), прибавляют 10 мл дис­ тиллированной воды, 5 мл 10%-ного раствора сульфосалициловой кисло­ ты, 5 мл 10%-ного водного аммиака, доводят объем колбы до метки дис­ тиллированной водой и перемешивают. Измеряют последовательно оп­ тическую плотность анализируемого и стандартного растворов в одной и той же кювете в одинаковых условиях. По полученным данным рассчи­ тывают массу m(Fe) железа(Ш) в исходном анализируемом растворе:

w(Fe) = т, А_ мг,

а ;

где т, = 0,20 мг — масса железа(111) в стандартном растворе объемом 50 мл; А и А, — оптическая плотность измеряемого и стандартного растворов соответственно. Массу железа рассчитывают в мг с точностью до двух значащих цифр.

2. Расчеты результатов ГЖХ-апализа с использованием метода внутренней нормализации. Лекарственный препарат, состоящий из d,l- ментола и изо-d, 1-ментола с незначительной примесью H eo-d,l-ментола, проанализировали методом ГЖХ на газовом хроматографе с пламенно­ ионизационным детектором при следующих условиях хроматографиро­ вания: колонка из нержавеющей стали длиной L = 3000 мм с внутренним диаметром 3 мм; неподвижная жидкая фаза — полиэтиленгликольадипинат, нанесенный на твердый носитель из хромосорба; газ-носитель — гелий, скорость потока газа-носителя 60 мл/мин; температура испарителя

438

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

220 ± 5 °С, колонки — 125 ± 5 °С; объем вводимой пробы (раствор смеси в 95%-ном этаноле в соотношении 1:1) от 0,5 до 1 мкл; продолжитель­ ность анализа — до 30 мин.

На хроматограмме (рис. 9.9), полученной в указанных условиях, имеются 3 пика разделенных компонентов смеси со следующими харак­ теристиками (/, ау2 и h — соответственно расстояние удерживания, по­ луширина пика и его высота, измеренные в мм), представленными во 2—4

439

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

где A/i и Д/2 — разность расстоянии удерживания для первой и второй пары компонентов соответственно; a(l)i/2 и а(2)1/2 и а(3)и2 — полушири­ ны пиков нео-d,1-ментола, d,1-ментола и изо-d,1-ментола соответственно. Полученные значения степени разделения больше единицы; следователь­ но, пики всех трех компонентов разделяются.

б) Число теоретических тарелок п вычислим по формуле (9.11), а вы­ соту, эквивалентную теоретической тарелке, Н — по формуле (9.12) для каждого компонента смеси, заменив время удерживания т на расстояние удерживания /, мм.

Для нео-d,1-ментола:

Для d,1-ментола:

Для изо-d,1-ментола:

2) Массовую долю W каждого компонента в процентах рассчитаем по формуле (9.15), воспользовавшись методом внутренней нормализации. Для этого вначале вычислим площадь каждого пика, приближенно считая пики равнобедренными треугольниками.

Для Heo-d.I-ментола:

S, = а(1)|/2^ = 3 • 2 = 6 мм2.

Для d,1-ментола:

S1 =t^2)m hl = 4 198 = 792 мм2.

Для изо-d,1-ментола:

S} = a(3)in h} =4-53,5 = 214 мм2.

Сумма площадей всех трех пиков равна:

SS, = 6 + 792+ 214= 1012 мм2.

Массовая доля в процентах равна:

440