1 курс / Химия / Kharitonov_Yu_Ya_-_Analiticheskaya_khimia_2_chast

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

Чем больше величина стоксова смещения, т.е. чем дальше отстоят друг от друга максимумы в спектре поглощения и в спектре флуоресцен­ ции данного вещества, тем надежнее можно разделить эти световые по­ токи при наблюдении и при регистрации спектров. Обычно спектр флуо­ ресценции смещен на ~50— 100 нм в длинноволновую область по сравне­ нию со спектром поглощения того же вещества и имеет более широкие полосы излучения (до -100—200 нм).

Энергетический выход фе люминесценции — это отношение энергии £/„„ излучаемой люминесцирующим веществом, к энергии £ abs погло­ щенного света:

Энергетический выход люминесценции характеризует эффектив­ ность преобразования поглощенной световой энергии в энергию люми­ несцентного излучения.

Квантовый выход ф люминесценции — это отношение числа излу­ ченных квантов люминесценции (флуоресценции) N,m к числу квантов N„bSпоглощенного возбуждающего излучения:

( 8. 11)

Чем больше квантовый выход флуоресценции, тем эффективнее преобразование возбуждающего света в излучение флуоресценции.

Квантовый выход флуоресценции зависит от длины волны возбуж­ дающего света, природы растворенного флуоресцирующего вещества и растворителя, концентрации раствора, температуры, присутствия приме­ сей в растворе.

Известный отечественный физик-оптик С.И. Вавилов установил сле­ дующую закономерность — закон Вавилова: квантовый выход флуорес­ ценции постоянен, если длина волны возбуждающего света (в определен­ ных пределах) меньше длины волны флуоресценции:

ф = const, если X,abs < Кп-

При X,abs > Х.|щ(антистоксова область) квантовый выход резко умень­ шается.

Из закона Вавилова следует: в определенном спектральном диапазо­ не (при A.abs < A|,J спектр люминесценции (флуоресценции) не зависит от того, каким участком спектра возбуждается люминесценция (флуорес­ ценция), т.е. спектр люминесценции (флуоресценции) не зависит от дли­ ны волны возбуждающего излучения.

Так, например, органическое соединение флуоресцеин люминесцирует при длине волны Х,Ьп = 560 нм. Эту флуоресценцию можно возбудить

361

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

излучением либо в видимой области с длиной волны Хаьх = 500 нм, либо УФ излучением. На практике удобнее вызывать флуоресценцию с помо­ щью возбуждающего УФ излучения, так как при этом будет больше сто­ ксово смещение.

Количественный флуоресцентный анализ. Рассмотрим кратко ос­ новы использования флуориметрии для проведения количественного анализа.

Принципы количественного флуоресцентного анализа. Метод ос­ нован на использовании прямой пропорциональной зависимости между интенсивностью люминесценции (флуоресценции) /im и концентрацией с

где к — коэффициент пропорциональности.

Зависимость (8.12) выполняется, если справедлив закон Вавилова, т.е. если квантовый выход постоянен: ф = const.

Покажем, что это, действительно, так. Очевидно, что интенсивность флуоресценции /|т пропорциональна числу квантов люминесценции N[m\

где к' — коэффициент пропорциональности. Поскольку по определению (8.11) квантовый выход

то N]m=фУаЬ5 и /1т = * y v abs.

Если выполняется основной закон светопоглощения, то можно счи­ тать, что число поглощенных квантов N„bs пропорционально концентра­ ции раствора с:

*ab S = k ’c,

где к ’ — коэффициент пропорциональности. Тогда

Itm= k'qk’c.

Если ф = const, то и произведение £ 'ф £ ' = const = к, поскольку к' =

= const и к ’ = const. Следовательно,

L = кс>

что совпадает с (8.12).

Чем больше квантовый выход ф, тем больше коэффициент пропор­ циональности к в выражении (8.12) и тем выше чувствительность флуо­ ресцентного анализа. Таким образом, флуоресцентный анализ следует

362

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

проводить в таких условиях, при которых квантовый выход флуоресцен­ ции был бы постоянным и максимальным'.

Условия проведения флуоресцентного анализа. Исходя из вышеиз­ ложенного, можно указать на оптимальные условия выполнения флуориметрических определений.

1) В соответствии с законом Вавилова для того, чтобы квантовый выход был постоянным, необходимо, чтобы выполнялось условие

^-abs m■

При выборе длины волны >.abs возбуждающего излучения следует учитывать, что ошибка определения /|т и, следовательно, концентрации определяемого вещества в анализируемом растворе будет тем меньше, чем больше разница между и А|т, т.е. чем больше стоксово смещение.

Обычно для возбуждающего излучения используют интервал длин волн 250— 800 нм.

2)Анализируемый раствор должен быть сильно разбавленным (кон­ центрация с < КГ4 моль/л). При увеличении концентрации с флуоресци­ рующего вещества в разбавленных растворах интенсивность люминес­ ценции (флуоресценции) вначале растет пропорционально концентрации (при условии постоянства квантового выхода), а затем резко падает; квантовый выход уменьшается.

Уменьшение интенсивности люминесценции при увеличении кон­ центрации раствора называется концентрационным тушением люминес­ ценции (флуоресценции). Минимальная концентрация, при которой уже наблюдается концентрационное тушение флуоресценции, называется пороговой концентрацией. Пороговая концентрация ограничивает верх­ ний предел диапазона определяемых концентраций (-КГ4 моль/л).

Концентрационное тушение флуоресценции можно объяснить тем, что при увеличении концентрации растворенного флуоресцирующего вещества возрастает число столкновений частиц и, как следствие, повы­ шается вероятность безызлучательной потери энергии возбужденными частицами.

3)Посторонние примеси должны быть удалены. При наличии посто­ ронних примесей может происходить как усиление, так и ослабление и даже тушение флуоресценции.

Усиление флуоресценции в присутствии примесей наблюдается то­ гда, когда флуоресцируют сами примеси.

Ослабление и тушение флуоресценции в присутствии примесей про­ исходит не только за счет увеличения числа столкновений флуоресци­ рующих частиц с примесями, при которых безызлучательно теряется энергия возбужденных частиц, но и вследствие того, что примеси могут

363

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

поглощать возбуждающее излучение и затем безызлучательно терять по­ глощенную энергию.

Присутствие растворенного кислорода также сильно способствует ослаблению и тушению флуоресценции.

Все реактивы, используемые при проведении флуоресцентного ана­ лиза, должны быть высокочистыми — особой чистоты.

4)Температура во время проведения флуориметрических измерений должна поддерживаться постоянной. При повышении температуры на­ блюдается температурное тушение флуоресценции.

5)В тех случаях, когда определяемое вещество не обладает собст­ венной флуоресценцией, проводят люминесцентную реакцию.

Люминесцентная реакция — такая химическая реакция, протекание которой сопровождается либо возникновением, либо исчезновением лю­ минесценции, либо изменением ее цвета. При проведении люминесцент­ ной реакции большую роль играют кислотность раствора, присутствие маскирующих реагентов, природа растворителя.

Собственной люминесценцией обладают немногие неорганические вещества (например, соединения урана и редкоземельных элементов) и многие органические соединения.

Большинство люминесцентных реакций предложено с целью опре­ деления катионов металлов.

Приведем некоторые примеры люминесцентных реакций.

а) Для флуориметрического определения катионов Li+, Ве2+, Mg2+, А13+ проводят люминесцентные реакции этих катионов с 8-оксихиноли- ном, в результате которых образуются флуоресцирующие внутрикомплексные соединения (сам 8-оксихинолин не флуоресцирует). В случае определения катионов алюминия проводят реакцию образования оксихинолината алюминия при pH = 6,5—9,5 по схеме:

А13+ + 3L~ = A1L3,

где L~ — оксихинолинат-ион

О

Образующийся комплекс алюминия AIL3 малорастворим в воде, по­ этому его экстрагируют из водной фазы хлороформом. Хлороформный экстракт комплекса окрашен в зеленый цвет. Комплекс в этом растворе обладает зеленой флуоресценцией; длина волны флуоресценции ком­ плекса Ki„, = 520 нм, длина волны поглощаемого (возбуждающего) ком­ плексом излучения \„ьх = 390 нм. Предел обнаружения катионов алюми­ ния этой люминесцентной реакцией равен 0,004 мкг в объеме раствора 1 мл.

364

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

б) Катионы натрия Na+ можно определить люминесцентной реакци­ ей с цинкуранилацетатом. Образующийся продукт реакции — натрийцинкуранилацетат люминесцирует зеленым светом — дает яркое зеленое свечение. Реакция специфична. Предел обнаружения катионов натрия этой реакцией составляет 2,5 мкг при предельном разбавлении, равном 20 000 мл/г.

в) Реакции образования кристаллофосфоров. Большинство веществ в кристаллическом состоянии не обладает собственной люминесценцией. Однако иногда введение в них определенных примесей соединений дру­ гих элементов (активаторов) приводит к возникновению характерной люминесценции. Такие вещества называют кристаллофосфдрами.

Среди неорганических кристаллофосфбров известны соли элементов I и II групп периодической системы, активированные такими металлами, как медь, серебро и некоторые другие. Например, олово(Н) можно опре­ делить по свечению кристаллофосфбра, представляющего собой иодид калия, содержащий олово. Для проведения анализа на фильтровальной бумаге проводят капельную реакцию хлорида олова(И) SnCI2 с иодидом калия. Затем бумагу подсушивают. Образующийся кристаллофосфбр при облучении УФ светом дает желтое свечение флуоресценции. Реакция высо­ кочувствительна. Предел обнаружения олова(Н) составляет около 0,02 мкг.

г) Люминесцентные реакции широко применяются в тонкослойной хроматографии для идентификации на хроматограммах пятен разделяе­ мых или определяемых веществ при облучении полученных хромато­ грамм УФ светом: наблюдается либо свечение пятен (в тех случаях, когда хроматографируемые вещества обладают собственной люминесценцией), либо, что бывает чаще, исчезновение свечения в зоне пятен (в тех случа­ ях, когда люминесцирует поверхность хроматографической пластинки, включающая люминесцирующий компонент, а сами хроматографируе­ мые вещества— не обладают собственной люминесценцией).

Методы определения концентрации. При использовании флуориметрического анализа концентрацию определяемого вещества в анализи­ руемом растворе находят по результатам измерения интенсивности флуоресценции либо методом градуировочного графика, либо методом одного стандарта.

Метод градуировочного графика. Готовят серию эталонных раство­ ров определяемого вещества с постепенно возрастающей концентрацией С|, с2, с3, ... . При необходимости проводят люминесцентную реакцию. Измеряют интенсивность флуоресценции /|т каждого эталонного раство­ ра в одних и тех же условиях. По полученным данным строят градуиро­ вочный график в координатах /im—с. Затем измеряют интенсивность лю­ минесценции анализируемого раствора в тех же условиях и по градуиро­ вочному графику находят концентрацию определяемого вещества в ана­ лизируемом растворе.

365

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

Метод градуировочного графика можно использовать и тогда, когда наблюдается отступление от прямой пропорциональной зависимости ме­ жду интенсивностью флуоресценции и концентрацией раствора.

Метод одного стандарта. Если выполняется закон Вавилова, то го­ товят стандартный раствор с точно известной концентрацией с, опреде­ ляемого вещества, близкой к концентрации сх того же определяемого ве­ щества в анализируемом растворе. В одинаковых условиях измеряют ин­ тенсивность флуоресценции стандартного I, и анализируемого /* растворов.

В соответствии с законом Вавилова для обоих растворов имеем

/,= kcs, lx —ксх,

где к — коэффициент пропорциональности. Отсюда получаем:

По уравнению (8.14) рассчитывают концентрацию определяемого вещества в анализируемом растворе.

Применение флуоресцентного анализа. Флуориметрия — высоко­ чувствительный фармакопейный метод количественного анализа. Его используют при определении очень малых количеств веществ в анализи­ руемом растворе.

Предел обнаружения определяемых веществ — весьма низкий: до ~1(Г8%. Метод позволяет определять малые концентрации — до КГ12— 10~15 г/л.

Аппаратурное оформление метода сравнительно несложно. Погрешности флуориметрического анализа обычно составляют око­

ло 2— 5%, хотя в отдельных случаях могут достигать 10%.

Метод широко применяется в фармакопейном анализе, например, при контроле качества фолиевой кислоты, этакридина лактата, хинина гидрохлорида, натрия парааминосалицилата, хлортетрациклина гидро­ хлорида, резерпина, тиамина хлорида и бромида, рибофлавина и др.

Предложены методики флуориметрического определения многих ка­ тионов металлов после перевода их в хелатные комплексные соединения люминесцентными реакциями с различными органическими соедине­ ниями, например, с 8-оксихинолином, 2,2'-дигидроксиазобензолом, дибензоилметаном и т.д.

Так, флуориметрически определяют содержание катионов магния в биологических жидкостях — в сыворотке крови, в моче — после перево­ да катионов магния в комплекс с 8-оксихинолином.

366

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

зуют различные, сравнительно простые по устройству, фотоэлектрофлуориметры.

На рис. 8.22 представлена принципиальная оптическая схема про­ стейшего флуориметра.

Луч света от источника / проходит через отверстие в диафрагме 2, первичный светофильтр 3, пропускающий свет с длиной волны возбуж­ дающего излучения, кварцевый конденсор (линзу) 4 и попадает в пробирку 5 с анализируемым раствором. Излучение флуоресценции собирается кон­ денсорами (линзами) 6 и 6' в направлении, перпендикулярном направле­ нию падающего возбуждающего светового потока, проходит через вторич­ ные светофильтры 7 и 7', пропускающие свет с длиной волны излучения флуоресценции, и попадает на фотоэлементы 8 и 8', которые преобразуют световую энергию в фототок. Этот фототок усиливается и регистрируется микроамперметром (или миллиамперметром). Показания на шкале микро­ амперметра пропорциональны интенсивности флуоресценции.

В качестве источника возбуждения УФ излучения часто применяют ртутную кварцевую лампу. Первичные светофильтры служат для выде­ ления спектрального диапазона с длиной волны возбуждающего излуче­ ния, а вторичные — для выделения участка спектра с длиной волны из­ лучения флуоресценции. В качестве приемника излучения применяют фотоэлементы и фотоумножители.

Анализируемым раствором заполняют пробирку, которую помеща­ ют в гнездо кюветного отделения.

367

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

Перед проведением измерений вначале в кюветное отделение вносят пробирку с чистым растворителем и устанавливают стрелку прибора на нулевое деление. Затем, если используют метод одного стандарта, изме­ ряют интенсивность флуоресценции стандартного раствора, устанавливая стрелку прибора приблизительно на середину шкалы.

Если же пользуются методом градуировочного графика, то после ус­ тановки стрелки прибора по чистому растворителю на нулевое деление измеряют интенсивность флуоресценции эталонного раствора с наи­ большей концентрацией определяемого вещества, устанавливая стрелку микроамперметра в интервале делений 80—90 (вся шкала прибора при этом соответствует 100 делениям).

После выполнения указанных операций измеряют интенсивность флуоресценции остальных эталонных растворов и анализируемого рас­ твора.

Все измерения необходимо проводить быстро во избежание разогре­ вания испытуемого раствора, что может привести к ослаблению и туше­ нию флуоресценции.

Кроме способа измерения интенсивности флуоресценции в направ­ лении, перпендикулярном по отношению к направлению возбуждающего излучения, разработаны и другие методы: фронтальное измерение (на­ правления возбуждающего светового потока и излучения флуоресценции находятся под острым углом) и регистрация в линию (направление изме­ ряемого излучения флуоресценции совпадает с направлением возбуж­ дающего светового потока). На практике эти методы применяются реже, обычно — в случаях сильно поглощающих сред.

Титрование с помощью флуоресцентных индикаторов. При флуориметрическом (флуорометрическом) титровании за ходом титрова­ ния следят по флуоресценции титруемого раствора либо визуально, либо фотометрически. При этом титруемый раствор облучается источником возбуждающего излучения (например, ртутной лампой). При фотометри­ ческом способе наблюдения за ходом титрования вычерчивают кривую титрования в координатах показание прибора (ось ординат) — объем прибавленного титранта (ось абсцисс). Положение КТТ находят экстра­ поляцией — по пересечению линейных участков кривой титрования в области изменения ее наклона.

Флуоресцентные индикаторы — такие органические соединения, которые при возбуждении лучами соответствующей длины волны изме­ няют флуоресценцию в точке эквивалентности или вблизи ее. Эти инди­ каторы применяются чаще всего в методах кислотно-основного титрова­ ния. Кислотно-основные флуоресцентные индикаторы обладают разной флуоресценцией в ионизированной и в нейтральной формах и характери­ зуются определенным интервалом изменения pH перехода (изменения) цвета флуоресценции.

368

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

Флуоресцентные индикаторы часто имеют узкий интервал перехода цвета флуоресценции, что повышает точность титриметрического анали­ за. Титрование обычно ведут в темноте при освещении титруемого рас­ твора, в который добавлен индикатор, источником возбуждающего излу­ чения.

В табл. 8.10 приведены в качестве примера характеристики некото­ рых распространенных флуоресцентных индикаторов.

Т а б л и ц а 8.10. Некоторые флуоресцентные кислотно-основные

Известны также хемилюминесцентные индикаторы, предложенные отечественным ученым А.К. Бабко. Возникновение, изменение цвета или исчезновение флуоресценции таких индикаторов вызывается протекани­ ем соответствующей химической реакции при достижении определенно­ го значения pH раствора. К хемилюминесцентным индикаторам относят­ ся, например, такие органические соединения, как (в скобках указан ин­ тервал изменения pH раствора, в котором возникает свечение флуорес­ ценции данного индикатора): М,]^Г-диметилбиакриден (pH = 9), лофин (8,9—9,4), люминол (8,0— 8,5), люцигенин (9,0— 10,0).

369

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ__________________ М М А им .И .М . Сеченова

Харитонов Ю.Я. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. АНАЛИТИКА. Кн. 2

8.4.Применение других оптических методов

вколичественном анализе

Рефрактометрия. Сущ­ ность метода рассмотрена в книге 1 (гл. 20, раздел 20.2.5). Применение метода в количе­ ственном анализе основано на использовании зависимости между показателем преломле­ ния (светопреломления) п ана­ лизируемого раствора и со­

Рис. 8.23. Зависимость показателя прелом­ держанием X определяемого ления п" водных растворов от содержания вещества в этом растворе.

Для растворов различных веществ в широком диапазоне изменения концентраций зави­ симость показателя преломле­

ния от концентрации раствора может быть как линейной, так и нелиней­ ной (рис. 8.23).

Если в некотором интервале изменений X и п эта зависимость ли­

где п — показатель преломления раствора, п0— показатель преломления

чистого растворителя (для воды =1,3330; = 1,3325), F — фактор,

равный величине прироста показателя преломления раствора при увели­ чении содержания растворенного вещества на 1%.

Фактор F находят экспериментально. Для этого измеряют значения показателей преломления п х и пг двух растворов с содержанием данного

Значения и, и п2 выбирают так, чтобы величина п испытуемого рас­ твора лежала как можно ближе к и, и пъ а сам интервал п2- пхбыл бы по возможности минимальным.

Так, например, показатели преломления водного раствора хло­ рида кальция при его содержании Х\ = 2,40% и Х 2 = 5,00% равны соответ­ ственно «[ = 1,3360 и п2= 1,3390. Тогда получаем:

370