Определение редуцирующей способности

1. В 5 мл среды—молока с метиленовым синим— засевают петлю исследуемой культуры с плотной питательной среды или 0,1 мл 18-часовой бульонной культуры и после 24 ч инкубации учитывают результаты роста. При положительной реакции на редукцию метиленового синего среда из голубой становится кремового цвета, а при слабоположи­тельной — приобретает зеленоватое окрашивание.

2. Пробирки с лакмусовым молоком, средой Минкевича засевают так же, как молоко с метиленовым синим, суточной культурой с плотной или жидкой питательной сре­ды. Посевы инкубируют в термостате в течение 10 дней, еже­дневно наблюдая за изменением цвета среды. Редукция лак­муса проявляется полным обесцвечиванием молока, имеюще­го розовато-сиреневый цвет до посева. В протоколе иссле­дования редукцию лакмуса обозначают буквой Р.

Среда Минкевича позволяет также выявлять кислото- или щелочеобразование, выражающееся соответственно в покрас­нении или посинении молочной среды. Образование кислоты обозначается буквой К, щелочи — буквой Щ.

Определение фермента каталазы

Некоторые виды микроорганизмов, принадлежащие к группе аэробов, в процессе дыхания образуют перекись водорода, являющую­ся клеточным ядом. Количество перекиси водорода в культуре никогда не достигает высоких концентраций, так как по ме­ре образования перекись расщепляется на воду и молекуляр­ный кислород при участии фермента каталазы. На поверх­ность микробной культуры, выращенной на плотной пита­тельной среде в чашке Петри, наносят 1—2 мл 1% раствора перекиси водорода так, чтобы она покрывала поверхность культуры тонким слоем. Появление пузырьков газа в слое нанесенной жидкости свидетельствует об образовании кис­лорода в результате расщепления перекиси водорода под действием каталазы. Подобный результат в протоколе опыта отмечается знаком + как положительный результат реакции на каталазу.

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Для успешного проведения лечения антибиотиками, особенно в случаях хронической инфекции, необходимо предварительно опреде­лить степень чувствительности к антибиотикам микробов, вызвавших заболевание. При определении чувствительности желательно иметь чистые культуры возбудителя и лишь при необходимости срочного получения ответа используют смешанные культуры, содержащие всю микрофлору, имевшуюся в исследуемом материале.

Наиболее прост и доступен метод определения чувствительно­сти с помощью дисков, пропитанных антибиотиками. В стерильные чашки Петри, расположенные на горизонтальной поверхности, раз­ливают по 15 мл плотной питательной среды (чаще всего 2% агар на переваре Хоттингера, содержащий 0,11—0,13% аминного азота). На поверхность застывшего и слегка подсушенного агара наливают 1 мл суспензии суточной культуры микроба-возбудителя или, если чистая культура не выделена, взятого для исследования патологи­ческого материала (гной, экссудат и т. п.), слегка разведенного изо­тоническим раствором хлорида натрия. Бактериальную взвесь равно­мерно распределяют по поверхности агара, а ее избыток удаляют пастеровской пипеткой. На поверхности засеянного агара пинцетом раскладывают диски с антибиотиками — по 5—6 дисков на каждую чашку на расстоянии 25 мм от центра чашки. Чашки выдерживают при 37°С 16—18 ч, после чего учитывают результаты опыта путем измерения зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самого диска. Размер зон зависит от степени чув­ствительности возбудителя к данному антибиотику. При зоне диа­метром до 10 мм штамм расценивается как устойчивый, 11–15 мм — как малочувствительный, 15–25 мм — как чувствительный. Зоны, превышающие 25 мм, свидетельствуют о высокой чувстви­тельности микроорганизма к данному антибиотику. Однако этот метод нельзя считать количественным.

Более точные результаты можно получить, применяя метод се­рийных разведений в жидкой среде. Бульон Хоттингера (или другую среду, пригодную для роста данного микроорганизма) разливают по 2 мл в пробирки, расставленные в штативы, по 10 в каждом ряду. Готовят раствор антибиотика, содержащий 100 ЕД в 1 мл, и добавляют 2 мл этого раствора в первую пробирку. После тща­тельного перемешивания новой стерильной мерной пипеткой пере­носят 2 мл из этой пробирки в следующую, и т. д. до девятой про­бирки, из которой 2 мл выливают. Десятая пробирка, не содержа­щая антибиотика, служит контролем роста культуры. Для поста­новки этого опыта вместо стандартов антибиотиков можно с успехом использовать имеющиеся в продаже препараты, на этикет­ке которых указано количество единиц во флаконе. Например, если флакон содержит 500000 ЕД пенициллина, то, добавив в него 10 мл дистиллированной воды, получают раствор, содержащий в 1 мл 50000 ЕД, при дальнейшем разведении в 100 раз получают раствор с концентрацией пенициллина 500 ЕД/мл. Для получения требуемой концентрации 100 ЕД/мл нужно развести этот раствор еще в 5 раз; это разведение делают при помощи бульона и 2 мл полученного раствора вносят в первую пробирку. Таким образом, в первой пробирке концентрация пенициллина 50 ЕД/мл, во вто­рой — 25 ЕД/мл и т. д. Если на этикетке препарата дозировка указана в весовых единицах, следует иметь в виду, что для большей части антибиотиков 1 г активного вещества соответствует 1 000 000 ЕД. Из этого расчета и следует разводить антибиотик.

Если порошок антибиотика расфасован не мерно, и на этикет­ке указано количество единиц активности в 1 мг, необходимо к точной навеске препарата (20—25 мг), сделанной на аналитических весах, добавить равный объем растворителя, т. е. получить раствор мг/мл, в 1 мл которого содержится столько единиц, сколько их было указано на этикетке. Из этого основного раствора делают дальнейшие разведения по указанной выше схеме. Суточную ага­ровую культуру испытуемого микроба смывают изотоническим раствором хлорида натрия и, определив густоту взвеси по стандарту мутности, разводят до густоты 10000 микробов в 1 мл. Полученную взвесь по 0,2 мл вносят во все пробирки ряда, начиная с контроль­ной. Таким образом, во всех пробирках содержится в 1 мл 1000 микроорганизмов. Результаты опыта учитывают после инкуба­ции при 37°С в течение 18—20 ч. Последняя пробирка с прозрач­ным бульоном при наличии густого роста в контроле определяет минимальную, подавляющую рост данного микроорганизма концен­трацию антибиотика.

Для определения чувствительности микробов к сульфаниламидам может быть применен любой из указанных методов, причем во внимание принимается только степень разведения навески пре­парата. Общую чувствительность к сульфаниламидам, как и к анти­биотикам, можно определить методом канавки. На агаре в чашке Петри по ее диаметру прорезают канавку, в которую вносят опре­деленное разведение изучаемого препарата. Перпендикулярно к канавке засевают штрихом изучаемые культуры микроорганизмов. После инкубации при 37°С 18—20 ч отмечают наличие участков задержки роста микроорганизмов, если последние чувствительны к данному препарату.

Выделение и практическое использование веществ антибиотиче­ской природы основано на взаимоотношениях между микроорга­низмами разных видов.

В настоящее время обнаружены также и антимикробные ве­щества, действующие внутри одного вида, что и отличает их от антибиотиков.