Видоизменения метода окраски по Граму

Как уже упоминалось выше, окраска по Граму представляет собой самый важный метод идентификации бактерий. Теоретически возможно разделить бактерии на две группы: грамположительные и грамотрицательные; реально же имеются случаи, когда одни и те же бактерии характеризуются как «грамвариабельные». С тех пор, как метод был впервые разработан Кристианом Грамом в 1884 г., опубли­кованы многочисленные модификации окраски по Граму. Мазок бактерий для окрашивания на предметном стекле получают прямым методом из куль­туры на жидкой или твердой среде, но лучше всего приготовить его из фиксированной формалином отмытой пробы. Несколько дополнительных минут, потраченных на суспендирование бактерий в 5%-ном (объем/объем) формалине, сбор и промывку их центрифугированием, окупаются тем, что размер и форма клеток хорошо сохра­няются, клетки прокрашиваются равномерно, а беспоря­дочно разбросанные преципитаты из жидких культуральных сред отсутствуют. В любом случае рекомендует­ся высушивать мазок на воздухе и фиксировать его на­греванием, как для простого окрашивания. Важно стан­дартизировать методику окраски по Граму. Одина­ковые результаты дают еще два способа окраски — в моди­фикации Хукера и в модификации Берка.

Окраска по Граму в модификации Хукера.

Раствор А для приготовления красящего реактива:
Кристаллический фиолетовый (с 90% содержанием сухого вещества)	2,0 г
Этанол 95% (объем/объем)	20 мл
Раствор Б для приготовления красящего реактива:
Щавелевокислый аммоний	0,8 г
Дистиллированная вода	80 мл

Растворы А и Б смешивают для получения красящего реактива кристаллического фиолетового. Оставляют на 24 ч и перед исполь­зованием фильтруют через фильтровальную бумагу.

Протрава:
Йод	1,0 г
Йодистый калий	2,0 г
Дистиллированная вода	300 мл

Йод и йодистый калий размельчают в ступке и медленно добав­ляют воду при постоянно продолжающемся размельчении, пока йод не растворится. Хранят в темной склянке.

Растворитель для обесцвечивания:
Этанол 95% (объем/объем)
Дополнительный краситель:
Сафранин О [2,5% (вес/объем) в 95% (объем/объем) этаноле]	10 мл.
Дистиллированная вода	100 мл

Выполнение метода:

1. Высушенный на воздухе фиксированный нагрева­нием бактериальный мазок погружают на 1 минуту в кра­сящий раствор кристаллического фиолетового.

2. Мазок промывают в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды в течение 2 с.

3. Мазок помещают в йодную протраву на 1 минуту.

4. Промывают его в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды в течение 2 с, после чего подсушивают промокательной бумагой.

5. Погружают мазок на 30 с в 95%-ный этанол, взбалтывая последний, после чего мазок подсушивают промокательной бумагой.

6. Погружают мазок на 10 с в дополнительный кра­ситель.

7. Промывают мазок в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке, после чего подсушивают промокательной бумагой.