Метод 1.

Экспериментально установлено, что для частиц, не обладающих истинным поглощением (т.е. таких, у которых D_и = D_рс) выполняется следующее уравнение:

где  и n – константы при постоянных условиях измерения и типе частиц. Величина n зависит от формы и размеров частиц и может быть от 0 до 4, а величина  - от концентрации рассеивающих частиц в объекте и телесного угла светосбора .

Предположим, что уравнение (1) справедливо и для частиц, обладающих истинным поглощением.

Если мы прологарифмируем это уравнение, то получим:

Из граничных условий также известно, что

Это уравнение также можно подвергнуть логарифмированию:

Для любого хромофора можно найти такой участок спектра, где он света не поглощает и его D_п = 0. На этом (и только на этом) участке спектра уравнение (4) приобретает вид:

И, поскольку мы оговорили, что истинное поглощение отсутствует, будем считать, что D_рс подчиняется уравнению (1). Тогда можно записать:

Из уравнения (5) вытекает, что в области спектра поглощения мутного (светорассеивающего) объекта, где истинное поглощение у входящих в его состав хромофоров отсутствует, должна выполняться линейная зависимость между lgD_и и lg.

Используя это, находим на измеренном нами спектре поглощения светорассеивающего объекта такую спектральную область, где хромофоры образца истинным поглощением не обладают. Если такой области на измеренном спектре нет – специально измеряем оптическую плотность при таких длинах волн. Для оксигемоглобина это самая длинноволновая часть видимой области спектра, с 650 до 750-800 нм. В этой (и только в этой) области строим зависимость между lg и lgD_и. Если все измерено правильно, зависимость будет линейной (прямой).

Далее экстраполируем полученную линейную зависимость в ту часть спектра, где есть истинное поглощение. По полученной калибровочной зависимости мы теперь можем найти величину некоторого lgD при каждом значении lg. На самом деле найденный lgD - это lgD_рс. Потенциированием находим собственно D_рс при каждой интересующей нас длине волны и, используя уравнение (3), рассчитываем величину D_п. Повторяя процедуру, строим исправленный спектр поглощения в нужном спектральном диапазоне.

Следует отметить, что только что описанный метод поправки дает несколько искаженные значения D_п. Дело в том, что, экстраполируя калибровочную прямую, построенную на основании уравнения (1), в спектральную область, где имеется истинное поглощение света в объекте, мы предполагаем, что уравнение (1) справедливо и при наличии истинного поглощения. Однако, это уравнение получено экспериментально, только для частиц, не обладающих истинным поглощением и, строго говоря, не применимо при наличии истинного поглощения. Связанные с особенностями метода искажения расчетного D_п особенно велики в выраженных максимумах спектра поглощения исследуемого объекта.

Этого недостатка лишен второй метод внесения поправок.

Метод 2.

Для реализации этого метода потребуются два спектра поглощения мутного объекта, полученные при разных значениях телесного угла светосбора (₁ и ₂). Пусть ₂ > ₁. Тогда D_и(₁) будет больше D_и(₂). Учитывая, что, согласно граничным условиям D_п от  не зависит, можно записать два уравнения:

Путем несложных алгебраических преобразований можно на основании этих двух уравнений получить следующее:

Поскольку мы оговорили, что форма зависимости D_рс = f () при изменении  не меняется (т.е. от  не зависит величина показателя n в уравнении (1)), то правая часть этого выражения не будет зависеть от . Обозначим эту часть выражения, как параметр К:

Используя это обозначение, получим:

Для расчета D_п по этому уравнению необходимо знать численное значение величины К. Для его определения пользуемся теми областями спектров поглощения исследуемых объектов, в которых истинное поглощение отсутствует и D_и=D_рс. В этих областях можно определить численное значение К по уравнению (6). Поскольку параметр К от длины волны тестирующего излучения не зависит, в других частях спектра его величина должна быть такой же.

Окончательный вид исправленного спектра поглощения рассчитываем, вычисляя величину D_п для каждой длины волны по уравнению (7)

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Задача настоящей работы состоит в практическом овладении навыками регистрации спектров поглощения светорассеивающих объектов (на примере эритроцитарных суспензий) и освоении методов внесения поправок на искажения, вносимые в результаты спектрофотометрии светорассеиванием.

Приборы и принадлежности:

1. Спектрофотометр СФ-46

2. Пластиковые кюветы толщиной 10 мм – 2 шт.

3. Эритроциты кролика

4. Физиологический раствор (0,9% водный раствор NaCl)

Задание. Регистрация спектров поглощения эритроцитарной суспензии и водного раствора гемоглобина

1. Включить спектрофотометр СФ-46. Порядок работы на этом приборе описан в соответствующем приложении (см.).

2. Приготовить суспензию эритроцитов кролика в физиологическом растворе с такой концентрацией оксигемоглобина, чтобы ее оптическая плотность в кювете толщиной 1 см при 415 нм и расположении кюветы около входной апертуры кюветного отделения (ближе к источнику излучения) не превышала 1,0 1,2.

3. Приготовить раствор оксигемоглобина в дистиллированной воде точно такой же концентрации.

4. Проверить, закрыта ли шторка кюветного отделения. Открыть крышку кюветного отделения. Установить кюветы с эритроцитарной суспензией и физиологическим раствором (контрольный образец) в кюветное отделение спектрофотометра СФ-46 таким образом, чтобы они располагались максимально далеко от выходной апертуры кюветного отделения (выходная апертура расположена в кюветном отделении справа). Закрыть крышку кюветного отделения.

5. Измерить пошагово спектр поглощения суспензии эритроцитов в спектральном диапазоне 400-700 нм. Шаг измерений: в области 400-440 нм – 2 нм; в области 440-520 нм – 5 нм; в области 510-590 нм – 2 нм; 590-700 нм – 10 нм.

6. Закрыть шторку кюветного отделения. Открыть его крышку и переместить кюветы с эритроцитарной суспензией и физиологическим раствором максимально близко к выходной апертуре.

7. Повторить измерения спектра поглощения.

8. Заменить эритроцитарную суспензию в кювете с образцом на раствор оксигемоглобина той же концентрации. Установить кювету с раствором оксигемоглобина в кюветное отделение максимально близко к выходной апертуре.

9. Повторить измерение спектра поглощения.

10. По результатам измерений рассчитать спектры поглощения эритроцитарной суспензии с поправками на искажения, вносимые светорассеиванием, двумя полуэмпирическими методами, описанными в теоретическом введении.

11. Построить графически измеренные и расчетные спектры поглощения в одной системе координат.