6

Работа № 2 Спектрофотометрия биологических суспензий на примере эритроцитов теоретическое введение

При применении спектрофотометрии для анализа свойств биологических объектов нужно иметь ввиду наличие у этих объектов ряда особенностей, которые, если их не учитывать, могут очень сильно исказить результаты измерений оптической плотности или светопропускания. Одна из таких особенностей – светорассеивание.

Определение: Светорассеиванием называется любое отклонение квантов света в веществе образца от первоначального направления распространения, если переизлучение квантов происходит менее, чем за 10^-12 с.

Светорассеивание связано с оптической неоднородностью объекта, т.е. наличием в нем областей с различными значениями коэффициента преломления света. При прохождении излучением такой области вследствие преломления или отражения направление распространения квантов изменяется – происходит светорассеивание.

Светорассеивание в биологических объектах бывает двух типов:

1. однократное, когда каждый квант в объекте меняет направление своего распространения в объекте не более 1 раза;

2. многократное, когда квант может изменить направление более, чем 1 раз.

Во всех случаях наличие светорассеивания в объекте приводит к завышению измеряемой спектрофотометром оптической плотности объекта (D_и). Это связано с тем, что часть рассеянных квантов отклоняется так сильно, что не попадает на фотодетектор спектрофотометра и не регистрируется. Прибор воспринимает такие кванты как поглощенные объектом, и D_и оказывается завышенной. При регистрации спектра поглощения, поскольку величина светорассеивания зависит от длины волны излучения, степень искажения D_и к тому же будет разной в разных частях регистрируемого спектра. Из-за этого вид спектра поглощения очень сильно искажается, и проведение качественного спектрофотометрического анализа оказывается невозможно.

При многократном светорассеивании накладывается еще один искажающий результаты фотометрии эффект. Дело в том, что при многократном рассеивании квант внутри объекта двигается по ломаной траектории, общая длина которой может оказаться существенно большей, чем толщина кюветы. А поскольку по закону Бугера-Ламберта-Бера величина оптической плотности прямо связана с расстоянием, проходимым квантом в веществе объекта (оптическим путем), а не с толщиной кюветы (как обычно принимается на практике), то при многократном светорассеивании оказывается завышенной и истинная оптическая плотность объекта (D_п), связанная с истинным поглощением.

Таким образом, при наличии в объекте светорассеивания решение качественной и количественной спектрофотометрических задач оказывается сильно затруднено.

Однако, имеется ряд приемов, которые позволяют правильно измерить D_п рассеивающих свет (мутных) объектов.

Поправки спектров поглощения на светорассеивание

Прежде всего, следует отметить, что ни один из описываемых ниже приемов не позволяет избавиться от увеличения оптического пути вследствие многократного рассеивания. Единственный способ сделать это – свести многократное светорассеивание к однократному. Для этого следует либо разбавить объект, либо, если это невозможно, применить кювету малой толщины.

После устранения многократного светорассеивания для правильного измерения истинного поглощения света в объекте лучше всего измерять оптическую плотность на спектрофотометрах, снабженных специальными устройствами, позволяющими исключить (или значительно ослабить) влияние светорассеивания на D_и. К таким устройствам относятся:

1. специальное кюветное отделение для мутных образцов, в котором объект расположен максимально близко к фотодетектору. Фотодетектор при этом снабжается фотокатодом большой площади, а выходное апертурное отверстие кюветного отделения делается большого диаметра.

2. Светорассеивающая пластинка – плоская пластинка с собственным светорассеиванием, много большим, чем возможное светорассеивание в объекте – располагаемая сразу за образцом, вплотную к нему;

3. интегрирующая сфера Ульбрихта – полая сфера, внутренняя поверхность которой покрыта диффузно отражающим свет материалом (например, сульфатом бария).

Наиболее эффективно применение интегрирующей сферы Ульбрихта, которая практически полностью исключает искажения, вносимые светорассеиванием в результаты спектрофотометрии. Однако не все спектрофотометры снабжены специальными устройствами для анализа мутных образцов. Поэтому на практике нередко для устранения внесенных светорассеиванием искажений D_и приходится вносить поправки в результаты измерений, основанные на полуэмпирических методах.

Рассмотрим теоретическую базу этих методов.

Граничными условиями их применения являются следующие допущения:

1. светорассеивание и истинное поглощение являются независимыми процессами и выполняется равенство

где D_рс - оптическая плотность объекта, связанная со светорассеиванием;

2. светорассеивание в объекте однократное и не приводит к значимому увеличению оптического пути;

3. величина D_п не зависит от телесного угла , в пределах которого кванты на данном приборе попадают на фотодетектор (телесного угла светосбора);

4. от этого телесного угла также не зависит и форма спектра рассеивания (т.е. вид зависимости D_рс = f ()).

Ясно, что для того, чтобы выправить искаженный светорассеиванием спектр (определить D_п = f ()), необходимо найти для D_рс зависимость от  в явном виде. Имеются два метода, позволяющие сделать это.