Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Roschupkin_1975 / Работа №9.doc
Скачиваний:
54
Добавлен:
12.02.2015
Размер:
402.94 Кб
Скачать

12

Работа № 8

Изучение хемилюминесценции биологических объектов, индуцированной ионами Fe2+, на примере суспензии яичных липопротеидов

Теоретическое введение Биологически значимые виды хемилюминесценции

Хемилюминесценциейназывается излучение квантов света при протекании химических реакций.

Принято выделять несколько типов хемилюминесценции, которые могут наблюдаться в биологических объектах или применяться при их изучении.

  1. Биолюминесценция. Это достаточно интенсивное свечение ряда живых организмов, возникающее вследствие наличия у них специальных ферментных систем, предназначенных для излучения квантов света. Наиболее известный пример биолюминесценции – свечение светлячков, определяемое наличием у них люциферин-люциферазной системы. Поскольку люциферин-люциферазная реакция энергозависима, она часто применяется для количественного определения содержания АТФ и других макроэнергетических соединений.

  2. Сверхслабое свечение.Этим термином обозначается очень низкоинтенсивное свечение биологических объектов в отсутствие специальных ферментных систем. Как правило, причиной сверхслабого свечения является генерация квантов света в ходе реакции диспропорционирования перекисных липидных радикалов, продуцирующихся в ходе перекисного окисления ненасыщенных жирнокислотных остатков липидных компонентов клеток и тканей. Интенсивность сверхслабого свечения низка и редко составляет более 103квант/с/см2.

  3. Фото-ирадиохемилюминесценция.Это испускание квантов хемилюминесценции объектом после воздействия на него оптического излучения (фотохемилюминесценция) или ионизирующей радиации (радиохемилюминесценция), наблюдающееся вследствие протекания в объекте темновых фото- или радиоиндуцированных химических реакций. Измерение кинетики и интенсивности фото- и радиохемилюминесценции естественных и искусственно введенных соединений достаточно часто используется для оценки состояния биологического объекта.

  4. Свечение хемилюминесцентных индикаторов. В некоторых случаях (например, при сверхслабом свечении) интенсивность хемилюминесценции самого исследуемого объекта оказывается весьма мала, что сильно затрудняет количественную регистрацию квантов хемилюминесценции. В таких случаях нередко прибегают к введению в исследуемый объект так называемых хемилюминесцентных индикаторов (например, люминола, лофина, люцигенина). Взаимодействуя с активными радикалами кислорода, эти соединения окисляются с формированием перекисей в электронно-возбужденном состоянии, которые излучают затем кванты света с очень высоким квантовым выходом. Рассмотрим это явление более подробно на примере самого распространенного из хемилюминесцентных индикаторов.Люминол (гидразид 3-аминофталевой кислоты) взаимодействует с гидроксильными радикалами (OH), образующихся в ходе распада перекиси водорода. Одна из предполагаемых схем испускания им квантов хемилюминесценции приведена ниже. Эта реакция лучше протекает в щелочной среде, а ее скорость сильно зависит от наличия ионов металлов переменной валентности (меди, кобальта, железа). В биологических объектах основная часть железа входит в состав гемов, поэтому люминол часто применяется для выявления даже следовых количеств гемсодержащих веществ. С другой стороны, некоторые клетки организма имеют специальные ферменты, предназначенные для продукции кислородных радикалов (например, миелопероксидаза в нейтрофилах или НАДФН-оксидаза в моноцитах). Этот факт делает хемилюминесцентный анализ с применением люминола и других хемилюминесцентных индикаторов очень удобным инструментом для исследования функциональных свойств таких клеток.

Хемилюминесценция, сопровождающая индуцированное ионами Fe2+перекисное окисление липидов в биологических объектах

Как следует из написанного выше, данный вариант хемилюминесценции относится к сверхслабым свечениям. Однако в работах Ю.А. Владимирова уже достаточно давно было показано, что интенсивность сверхслабого свечения биологических объектов значительно возрастает в присутствии ионов Fe2+ (Владимиров Ю.А.Сверхслабые свечения при биохимических реакциях. М.: Наука, 1966; Владимиров Ю.А., Арчаков А.И.Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972). Причиной этого является стимуляция данным ионом процесса перекисного окисления липидов в объекте. Впрочем, влияние ионовFe2+ на скорость этого процесса неоднозначно и зависит от концентрации этих ионов в образце. Дело в том, что в процессе перекисного окисления липидов ионыFe2+могут выступать (1) в роли инициаторов (формируя свободные радикалы воды), (2) в качестве катализаторов (за счет разрушения липидных гидроперекисей до свободных радикалов, дающих начало новым цепям окисления), и (3) в качестве ингибиторов, перехватывая часть образующихся в ходе перекисного окисления свободных радикалов. Математическое моделирование кинетик перекисного окисления липидов при различных концентрацияхFe2+показывает, что при концентрации свыше 10-5М эти ионы преимущественно снижают скорость данного процесса, тогда как при концентрациях порядка 10-6М и ниже – активируют перекисное окисление липидов (Владимиров Ю.А., Суслова Т.Б., Оленев В.И.Хемилюминесценция, сопряженная с образованием липидных перекисей в биологических мембранах.Биофизика, 1969,14, 510; Биофизика, 1969,14, 838). Следует иметь в виду, что ионыFe2+относительно устойчивы только в кислой среде. При физиологических же (нейтральных) рН они достаточно быстро переходят в формуFe3+, а концентрацияFe2+в образце постепенно снижается (речь в данном случае идет о введенииFe2+извне, в норме свободныеFe2+ в биологических объектах практически отсутствуют, все имеющееся железо находится в трехвалентном состоянии и связано с белками), и изначально блокировавшие окисление липидов ионыFe2+достаточно быстро становятся активаторами этого процесса. Вместе с тем, скорость продукции перекисных липидных радикалов (RO2) прямо влияет на интенсивность хемилюминесценции (см. ниже). Поэтому кинетика индуцированной ионамиFe2+хемилюминесценции биологических объектов носит достаточно сложный характер (рис. 1).

Интенсивность индуцированной ионами Fe2+хемилюминесценции зависит от очень большого числа факторов, которые оказывают воздействие на скорость генерации возбужденных продуктов и квантовый выход их свечения. К таким факторам можно отнести величину рН (из-за его влияния на скорость перехода двухвалентного железа в трёхвалентное), долю ненасыщенных жирнокислотных остатков в липидах («индекс ненасыщенности»), фазовое состояние липидов в мембранах и т.д. Одним факторов является присутствие ионов фосфатов. Эти ионы катализируют переходFe2+ Fe3+, ускоряя исчезновениеFe2+из образца. Очень сильно сказывается на интенсивности описываемого варианта сверхслабого свечения присутствие в биологических объектах различного рода тушителей и активаторов хемилюминесценции. Это соединения разных классов, которые могут соответственно ослаблять или увеличивать интенсивность хемилюминесценции.

Все тушители и активаторы хемилюминесценции могут быть условно разделены на две большие группы. Химические тушители и активаторы воздействуют на скорость химических реакций, приводящих к появлению продуктов в электронно-возбужденном состоянии. Если говорить о сверхслабом свечении, то примером классического химического тушителя хемилюминесценции могут быть липидные антиоксиданты. К ним относится, в частности,-токоферол, содержащийся в клеточных мембранах и специально предназначенный для их предохранения от повреждения перекисным окислением липидов.Физические тушители и активаторы хемилюминесценции на скорость генерации электронно-возбужденных продуктов влияния не оказывают. Их действие связано с тем, что они в ходе столкновений с этими продуктами «перехватывают» энергию электронного возбуждения, излучая ее затем с меньшим (тушители) или большим (активаторы), чем у исходного электронно-возбужденного продукта, квантовым выходом.

Если речь о чисто физическом тушении хемилюминесценции, то известна точная зависимость этой интенсивности (Jхлс) от концентрации тушителя ([C]). Эта зависимость имеет следующий вид:

где Jхл0– интенсивность хемилюминесценции в отсутствие тушителяС, а константуКпринято называтьконстантой тушения.

Удобнее, однако, пользоваться другой формой этого выражения:

Рисунок 1.Примерные кинетики изменения концентрацииFe2+в содержащем ненасыщенные жирнокислотные остатки биологическом объекте при физиологических рН (1) и индуцированной этими ионами хемилюминесценции (2).Обозначения:ШТ – момент открывания шторки фотодетектора хемилюминометра;ЛП– продолжительность латентного периода между введениемFe2+в объект и началом медленной вспышки хемилюминесценции. Горизонтальными линиями отмечены уровни концентрацииFe2+ в 10-3(верхняя линия) и 10-5(нижняя линия) М.Jхл– интенсивность хемилюминесценции. Вертикальной стрелкой отмечен момент введенияFe2+в объект. На первом этапе введенные извнеFe2+разрушают уже имевшиеся в образце липидные перекиси. Вследствие диспропорционирования образующихся при этом свободных радикалов наблюдается начальная вспышка хемилюминесценции (так называемая «быстрая вспышка»), амплитуда которой отражает количество уже имевшихся в объекте на момент введенияFe2+перекисей. Эта вспышка очень быстро заканчивается, поскольку концентрацияFe2+в объекте пока еще очень велика, и новые цепи свободнорадикального перекисного окисления не развиваются из-за перехвата свободных радикалов ионами даного металла. Со временем, однако, концентрацияFe2+в объекте падает. По достижении этим показателем 10-5МFe2+скорость генерации новых радикалов, катализируемой этими катионами, начинает превышать скорость перехвата ими данных ракалов. В результатеFe2+из ингибитора перекисного окисления ненасыщенных жирнокислотных остатков становится его активатором, и развивается вторая («медленная») вспышка свечения. Эта вспышка будет продолжаться до тех пор, пока всё двухвалентное железо в объекте не перейдет в трёхвалентную форму.

Уравнение (1) называется уравнением Штерна-Фольмера.Оно справедливо не только для случая хемилюминесценции, но и для случая кинетического физического тушения фотолюминесценции. Обратите внимание на то, что, согласно этому уравнению, зависимость отношения интенсивностей люминесценции в отсутствие и в присутствие тушителя от его концентрации носитлинейный характер. Этот факт позволяет применять уравнение Штерна-Фольмера для оценки характера тушения люминесценции различными соединениями. Если построенная в координатах

зависимость Jхлот концентрации тушителя[C] оказывается линейной, значит, имеет место физическое кинетическое тушение. Координаты (2) называютсякоординатами Штерна-Фольмера.

Для случая физических активаторов концентрационная зависимость Jхлописывается более сложным уравнением:

Входящая в это выражение величина А отражает соотношение квантовых выходов люминесценции активатора и исходного электронно-возбужденного продукта. Численно величинаА определяется по формуле:

где -интенсивность хемилюминесценции образца при очень высокой (насыщающей) концентрации активатора в нем (формально – интенсивность хемилюминесценции при[C] ). КонстантаК в данном случае называется константой активации. Если в эксперименте зависимостьот[C] получается линейной, значит активатор – физический.

Соседние файлы в папке Roschupkin_1975