Roschupkin_1975 / Работа №3

9

РАБОТА № 3

Количественная фотометрия неоднородных биологических объектов

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ВВЕДЕНИЕ

Одна из распространенных трудностей при количественной фотометрии биологических объектов заключается в том, что поглощающие свет соединения распределены по их площади неоднородно, и их концентрация в разных частях объекта неодинакова. Вместе с тем, однородность объекта – одно из условий выполнения закона Бугера-Ламберта-Бера.

В сравнении с объектами, хромофорные соединения в которых распределены равномерно, неоднородные объекты поглощают свет слабее, а спектры их поглощения «сглажены». Математическое обоснование этого факта можно найти в работе Л.Н. Белла (Белл Л.Н. Замечания о коэффициенте и спектре поглощения нерассеивающих неоднородных сред. Биофизика, 1963, 8, №5, с. 629-638).

Поскольку прямое измерение количества хромофора в объекте с его неоднородным распределением дает заниженные значения, при фотометрии таких объектов требуется внесение поправок. Можно, например, фотометрировать объект не в максимуме поглощения определяемого вещества, а при тех длинах волн, где его оптическая плотность относительно невелика. При небольших значениях оптической плотности ошибка ее определения в неоднородных объектах также будет относительно невелика. Но такой подход значительно снижает чувствительность фотометрического анализа. Поэтому чаще прибегают к другому приему, основанному на определении оптической плотности неоднородного объекта при двух длинах волн тестирующего излучения.

Определение количества вещества в неоднородных объектах методом фотометрирования при двух длинах волн.

Сопоставим однородный и неоднородный объекты при условии, что количество хромофора в обоих случаях одинаково. Для этого введем следующие обозначения:

• S - площадь освещенной поверхности объектов, совпадающая с площадью тестирующего пучка монохроматического излучения;

• J₀ – световой поток, падающий на эту поверхность, выраженный в квантах/секунду;

• m – количество хромофора в объектах, выраженное в молях;

• dm/dS – поверхностная плотность хромафора

В случае однородного объекта

где С и l – концентрация вещества в объекте (количество вещества в единице объема) и толщина объекта. Согласно закону Бугера-Ламберта-Бера:

где К – поверхностный коэффициент поглощения, равный 10^-3 моль^-1см²; а J – выходящий из объекта световой поток.

Для неоднородного объекта

При этом вид зависимости dm/dS=f(S) неизвестен.

Разобъем неоднородный объект на такие маленькие фрагменты площадью dS каждый, чтобы неоднородностью распределения хромофора в пределах фрагмента можно было пренебречь. Закон Бугера-Ламберта-Бера в каждом из фрагментов будет выполняться и, соответственно, выходящий из каждого фрагмента световой поток dJ будет равен:

Полный световой поток J’, выходящий из неоднородного объекта площадью S, тогда будет составлять:

Отсюда

Трансформируем последнее уравнение в следующий вид;

Разложим подъинтегральное выражение в ряд Тейлора и будет интегрировать его по частям:

Прологарифмировав последнее уравнение с учетом того, что lg(J₀/J’)=D’ (оптическая плотность неоднородного объекта), а Km/S = D (оптическая плотность однородного объекта), получим:

Из анализа полученного выражения вытекает, во-первых, что оптическая плотность неоднородного объекта всегда меньше, чем оптическая плотность однородного с тем же количеством хромофора, а, во-вторых, что второй член правой части выражения и является отличием неоднородного объекта от однородного, т.е. отражает неоднородность. К сожалению, точно рассчитать численное значение этого члена невозможно, поэтому будем искать приближенные решения.

Измерим D’ при двух длинах волн ₁ и ₂. Введем величину Q=D’(₂)/D’(₁) и параметр =К₂/К₁. Величина Q будет прямо зависеть от степени неоднородности распределения хромофора в объекте. В однородном объекте Q=D’(₂)/D’(₁)= К₂/К₁=. Если же хромофор распределен предельно неоднородно (весь стянут в безразмерную точку с бесконечной концентрацией вещества) Q1 (эта точка будет одинаково непрозрачна для излучения с любой длиной волны, т.е. поглощение не зависит от К).

Имея две величины D’ можно составить систему уравнений из двух выражений (1). Одно из приближенных решений этой системы уравнений имеет вид:

К сожалению, на практике К₁ и К₂ обычно неизвестны. Но, если необходимо знать не абсолютное количество вещества (массу) хромофора в объекте, а только относительную (т.е. некий показатель, пропорциональный массе, обозначим этот показатель m_отн), то ее можно определить при условии, что величины  в сравниваемых объектах одинаковы и постоянны. Тогда применяется следующее выражение:

где q – параметр, зависящий от Q. В приложении к данной работе приведена таблица для перевода величины Q в значения q (таблица публикуется по работе Шерудило А.И. Определение количества поглощающего свет вещества при цитофотометрии существенно негомогенных объектов. Биофизика, 1968, 13, №4, с. 741-744). На практике данный прием реализуется следующим образом. На спектре поглощения неоднородных объектов выбирают такой участок, чтобы D’(₁) было меньше 1,2. Измеряют площадь всех сопоставляемых объектов S. Вычисляют для каждого из объектов величины Q, а исходя из них – значения q. Далее подставляют найденные величины в указанное выше уравнение для расчета m_отн. Полученные величины сопоставляют друг с другом, приняв минимальную из них за условную 1 и выразив остальные через нее. Если хотя бы для одного из образцов известны К₂ и К_1, можно рассчитать и абсолютные содержания исследуемого хромофора во всех объектах.

Уравнение (2) применимо при условии, что

Если величина  точно неизвестна, подбирают такие длины волн тестирующего излучения, чтобы

Этого достаточно, чтобы  оказалась в нужных пределах.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Задача настоящей работы состоит в практическом овладении навыками регистрации спектров поглощения неоднородных объектов (на примере сухих гемоглобиновых пленок) и освоении метода расчета относительной массы хромофора в них.

Приборы и принадлежности:

1. Спектрофотометр на базе модифицированного СФ-4А

2. Стеклянные пластины для нанесения гемоглобиновых пятен.

3. Кюветодержатель для сухих образцов со встроенной светорассеивающей пластиной

4. Эритроциты кролика

Задание. Регистрация спектров поглощения сухих гемоглобиновых пятен

1. Включить спектрофотометр. Схема прибора приведена на рис. 1. Включение осуществляется путем последовательного включения входящих в него блоков: (1) общего источника питания всей установки, стабилизатора напряжения; (2) источника питания лампы накаливания (тумблер включения расположен на левой боковой панели внизу); (3) рН-метра ОР-211 (кнопка включения расположена на задней панели, рН-метр используется в режиме милливольтметра и служит для регистрации электрических сигналов фотодетектора) и (4) источника питания фотодетектора (ФЭУ-38, сетевой тумблер расположен на передней панели слева внизу). Обратите внимание на то, чтобы на приборах светились индикаторные лампы, указывающие на факт их включения. Показания рН-метра при закрытой шторке кюветного отделения и включенном источнике питания ФЭУ должны быть равны 0. Если они отличны от 0, следует компенсировать фоновый сигнал регулировочной ручкой «STD1» на передней панели прибора.

2. Приготовить образцы. Для подготовки образцов на имеющиеся стеклянные пластинки наносится цельная крови или эритроцитарный осадок (гематокрит около 80%). На первую из пластинок строго по центру наносится 0,02 мл крови или эритроцитарного осадка, на вторую – 0,04 мл, на третью – 0,06 мл. Поскольку предполагается, что количество гемоглобина в единице объема крови или эритроцитарного осадка – величина постоянная, соотношение масс оксигемоглобина в полученных образцах будет составлять 1:2:3. С помощью острого предмета, например, простого, хорошо заточенного, карандаша, нанесенная кровь или эритроцитарный осадок осторожно распределяются по поверхности пластины с тем, чтобы получить пятна строго круглой формы диаметром 10-15 мм. Пластины с нанесенным гемоглобином подсушиваются до такой степени, чтобы при вертикальном положении пластинки нанесенная капля не стекала. Не рекомендуется готовить все три образца одновременно – при пересушивании часть гемоглобина из пятна может осыпаться. Лучше всего каждый последующий образец готовить незадолго до окончания измерения спектра поглощения предыдущего. Диаметры всех пятен регистрируются, поскольку знание их площади (в см²) необходимо для расчета относительной массы гемоглобина (см. «Теоретическое введение»).

3. Измерить спектры поглощения пятен гемоглобина в спектральной области 400-700 нм. Для этого пластину с пятном гемоглобина установить в кюветодержатель и закрепить ее там прижимной пружиной. Кюветодержатель с образцом установить в выходную апертуру кюветного отделения спектрофотометра. Внимание: Шторка фотодетектора в момент открытия крышки кюветного отделения должна быть закрыта. Несоблюдение этого требования может вывести фотодетектор из строя! Настроить монохроматор спектрофотометра на длину волны тестирующего излучения 580 нм. Открыть выходную щель монохроматора до максимума. С помощью ручки регулировки ширины ирисовой диафрагмы и винтов регулировки положения тестирующего светового зонда добиться максимального совпадения границ гемоглобинового пятна и светового зонда. По достижении этого извлечь кюветодержатель из выходной апертуры кюветного отделения, извлечь пластину с гемоглобиновым пятном из кюветодержателя, а «пустой» кюветодержатель вернуть в кюветное отделение на прежнее место. Закрыть кюветное отделение и светоизолировать его с помощью дополнительного тканевого покрытия. Открыть шторку фотодетектора. Постепенно уменьшая ширину выходной щели монохроматора (регулировочная ручка расположена на монохроматоре наверху справа, под окошком с указателем текущей ширины выходной щели), добиться того, чтобы величина регистрируемого фотосигнала составляла 1000 мВ. Поскольку по схеме включения ФЭУ «+» подан на «землю», фотосигнал регистрируется рН-метром (милливольтметром) как «минус милливольты», и на «минус» перед цифрой на шкале прибора не следует обращать внимания. Перенастроить монохроматор на 400 нм (ручка настройки пропускаемой длины волны расположена слева по центру панели прибора) и замерить величину фонового сигнала как функцию длины волны тестирующего излучения. Шаг измерений: в области 400-440 нм – 2 нм; в области 440-520 нм – 5 нм; в области 520-590 нм – 2 нм; 590-700 нм – 10 нм. Измерение фонового сигнала необходимо для того, чтобы имелась возможность расчета в дальнейшем величины оптической плотности исследуемых гемоглобиновых пятен, поскольку этот расчет требует знания двух значений световых потоков на каждой из длин волн тестирующего излучения, J и J₀, т.е. потока света через хромофор и потока света без него (фонового). Напомним, что оптическая плотность D по определению есть lg(J₀/J). Окончив измерения зависимости J₀=f(), закрыть шторку фотодетектора, открыть кюветное отделение, извлечь кюветодержатель, возвратить пластинку с гемоглобиновым пятном в кюветодержатель, а его – в кюветное отделение. Поскольку достаточно часто гемоглобиновое пятно бывает расположено на стеклянной пластинке не точно по центру, требуется проверить, насколько хорошо его границы совпадают с границами светового зонда. Для этого, предварительно записав ширину выходной щели, на которой регистрировались величины J₀=f(), открыть эту щель и настроить монохроматор на зеленое излучение. Если из-за эксцентричного положения пятна оно выходит за пределы светового зонда, следует повторно добиться его «вписывания» в световой пучок, поворачивая кюветодержатель в отверстии выходной апертуры. Обратите внимание: Изменять положение светового зонда на образце и ширину ирисовой диафрагмы в этот момент уже нельзя! По достижении максимально возможного «вписывания» гемоглобинового пятна в световой зонд закрыть крышку кюветного отделения, светоизолировать его, вернуть ширину выходной щели монохроматора к той величине, которую она имела во время измерения J₀=f(), настроить монохроматор на 400 нм и измерить зависимость J=f(). Измерения проводятся на тех же длинах волн, где регистрировалась величина J₀. Закончив измерения, пластину с гемоглобиновым пятном поместить в стеклянный стаканчик и залить 4 мл дистиллированной воды. Последовательность действий при измерении спектров поглощения следующих образцов уже не требует повторного измерения J₀=f(), но необходимо настроить спектрофотометр таким образом, чтобы эта зависимость была такой же, как уже измеренная. Для этого новый образец помещается в кюветодержатель, который устанавливается в кюветное отделение. Затем монохроматор настраивается на длину волны 580 нм, его выходная щель максимально раскрывается, и выполняется «вписывание» нового пятна в световой зонд. Затем пластина с пятном извлекается из кюветодержателя, который возвращается в кюветное отделение. Крышка кюветного отделения закрывается, оно дополнительно светоизолируется. После открывания шторки фотодетектора путем постепенного закрывания выходной щели монохроматора сигнал фотодетектора доводится до 1000 мВ. Ширина щели, при которой это будет достигнуто, скорее всего, будет отличаться от той, при которой проводились измерения спектра поглощения первого образца, поскольку трудно добиться точного совпадения площадей тестируемых гемоглобиновых пятен в разных образцах. Далее измерения проводятся также, как и при анализе зависимости J=f() для первого пятна. Единственное отличие – ширина выходной щели монохроматора во время измерений должна быть другой, такой, чтобы величина J₀ при 580 нм составляла 1000 условных единиц, несмотря на изменившуюся площадь поперечного сечения светового зонда.

4. Построить спектры поглощения оксигемоглобина в сухих пленках. Зная величины J и J₀ при каждой из длин волн тестирующего излучения, рассчитать соответствующие величины оптической плотности и построить спектры поглощения всех 3 исследованных гемоглобиновых пятен с помощью программы «Micsoft Exel».

5. Рассчитать относительные массы гемоглобина в сухих пленках. Расчет проводится согласно методике, описанной в теоретическом введении (см. выше).

6. Определить отношения масс гемоглобина в смывах сухих пятен. Смыть гемоглобиновые пятна со стеклянных пластинок 4 мл дистиллированной воды (каждое из пятен смывается по отдельности). Измерить оптические плотности смывов при 578 и 620 нм на спектрофотометре СФ-46 (работа №3). Как показатель относительной массы гемоглобина в смыве используется величина D = D₅₇₈-D₆₂₀. Соотношение D в трех исследованных образцах наиболее точно отражает истинное соотношение содержаний в них гемоглобина.

7. Требования к представляемым результатам. В отчете по работе должны содержаться (1) спектры поглощения сухих пленок гемоглобина и (2) таблица с величинами соотношения количества гемоглобина в образцах, определенными 2 способами: по сухим пленкам и по смывам этих пленок. В выводе следует указать (если это наблюдается), почему относительные массы, определенные разными способами, отличаются друг от друга и от исходного соотношения (1:2:3).

Приложение

Таблица для перевода величины Q в величину q