Работа № 4 Микроспектрофотометрия на примере эритроцитов теоретическое введение
Микроспектрофотометрия позволяет оценить количество хромофоров в единичных клетках и даже в их отдельных органеллах. Большим преимуществом этого метода является именно возможность изучения отдельной клетки, а не целой их совокупности, как при обычной фотометрии.
Основу любого микроспектрофотометра составляет обычный световой микроскоп. Однако в оптическую схему этого прибора помещаются диафрагмы разных типов, которые позволяют выделить в поле зрения отдельный, интересующий исследователя, объект – клетку или даже ее часть.
Объектив микроскопа создает действительное увеличенное изображение около фокуса главной линзы окуляра. Поэтому диафрагму часто устанавливают именно в плоскости этого изображения (рис. 1).
Для совмещения изображения выбранного для фотометрии участка поля зрения с отверстием диафрагмы требуется визуальной контроль. Это удобно делать в тех случаях, когда используется бинокулярный микроскоп – тогда можно использовать один из каналов для фотометрии, а другой – для визуальных настроек. Если же канал только один, настраивать микроскоп, используя зрительные ориентиры в поле зрения, и фотометрировать выбранную область объекта приходится поочередно.
Микроспектрофотометрия имеет ряд особенностей, которые могут сильно повлиять на результаты исследования. Часть трудностей связана с общими свойствами всех биологических объектов (светорассеивание, неоднородное распределение хромофора по площади объекта), но одна особенность связана именно с малыми размерами фотометрируемых клеток. Дело в том, что средние размеры клеток человека и млекопитающих имеют порядок микрометров, т.е. 10-6м, а исследуется поглощение излучения с длинами волн порядка сотен нанометров, т.е. 10-7м. Из-за близости длины волны тестирующего излучения и размера объекта возникает явление дифракции («огибания» световой волной препятствия) и развивается так называемое дифракционное засвечивание. Дифракция приводит к тому, что часть квантов излучения от краевых частей объекта, которые не должны были бы попасть на фотодетектор, все-таки регистрируются. В результате оптическая плотность оказывается сильно заниженной. Более того, при сильном дифракционном засвечивании, когда на фотодетектор попадают кванты, вообще не проходящие через исследуемую клетку, регистрируемый световой потокJ оказывается даже больше фонового (J0), а оптическая плотность формально приобретает отрицательные значения (что, естественно, при фотометрии просто невозможно).
Исправить ситуацию позволяет ограничение площади тестирующего или регистрируемого пучков, которое исключает края объекта из области регистрации. В принципе, чем меньше апертура объектива и чем меньше освещенная площадь на объекте, тем меньше влияние дифракционного засвечивания.
Для ограничения поля зрения применяются диафрагмы разных типов, переменного (ирисовые и диафрагмы из двух «скрещённых» щелей монохроматора) или постоянного сечения (последние применяются в виде наборов сменных диафрагм постоянного сечения).
