Место проекции диафрагмы фотонасадки

Штрихи координатной сетки

Рисунок 4. Схема положения места проекции отверстия диафрагмы фотонасадки (поля «зрения» ФЭУ) в визуальном поле микроскопа.

Задание 3. Регистрация содержания оксигемоглобина в отдельных эритроцитах методом фотометрирования в двух полях.

1. Повторить пункты 515 задания 2.

2. Настроить монохроматор микроспектрофотметра на длину волны излучения, соответствующую максимуму поглощения на измеренном вами спектре поглощения эритроцита.

3. Зарегистрировать величину фотосигнала (J₁, диафрагма фотонасадки максимально мала).

4. Полностью открыть диафрагму фотонасадки, переведя ручку ее регулировки (см. выше) в крайнее левое положение.

5. Повторно зарегистрировать величину фотосигнала (J₂, диафрагма фотонасадки максимально открыта).

6. Закрыть шторку фотозатвора. Наблюдая поле зрения в зрительную трубу, увеличивать длину волны тестирующего излучения до тех пор, пока изображение исследуемой клетки не станет достаточно хорошо заметно. Убедиться в том, что исследуемый эритроцит не сдвинулся с того месте, на которое был ранее установлен. Если этого не произошло, сдвинуть эритроцит в сторону таким образом, чтобы в поле «зрения» ФЭУ оказался заведомо свободный от клеток участок поля. Повторить выполнение пунктов 25. Полученные значения фотосигнала – это величины фонового светового потокаJ₀₁(диафрагма максимально закрыта) иJ₀₂ (диафрагма максимально открыта). При правильно проведенных измеренияхJ₀₁> J₁, аJ₀₂>J₂. Рассчитать соответствующие значения светопропусканий клетки при малом и большом диаметре диафрагмы фотонасадки (соответственноТ₁ и Т₂).

7. Подобным же образом измерить Т₁ и Т₂ у 30 эритроцитов.

8. С помощью формул, приведенных в теоретическом введении к данной работе, рассчитать содержание оксигемоглобина (m) в каждом из исследованных эритроцитов. Используя программу «Exel», рассчитать среднее значениеm и величину ошибки ее определения (стандартную ошибку). Проверить правильность полученного значенияm можно путем расчета на ее основе среднего содержания оксигемоглобина в 1 л цельной крови (молекулярная масса гемоглобина – около 70000, в 1 мм³крови в норме содержится около 5000000 эритроцитов). Очевидно, что весь гемоглобин в 1 л крови не может весить существенно больше 1 кг.

9. Найти среди данных о массе гемоглобина в исследованных эритроцитах максимальное и минимальное значения m. Интервал между этими значениями разбить на 10 равных подинтервалов. Например, минимальное значениеm составило 1 ед., максимальное – 11 ед. Весь интервал значений (m), таким образом, составит 11-1=10 ед. Следовательно, ширина каждого из подинтервалов будет равна 1, а сами эти подинтервалы будут следующие: 12; 23; 34; 45; 56; 67; 78; 89; 910 и 1011 ед. Определить, у скольких клеток величинаm попадает в каждый из выделенных подинтервалов. На основании этих данных построить с помощью программы «Exel» гистограмму распределения эритроцитов по содержанию в них оксигемоглобина. По полученной гистограмме оценить однородность исследованной эритроцитарной популяции.

По окончании работы все приборы, входящие в состав экспериментальной установки, выключаются. Использованные предметные и покровные стекла следует обязательно промыть, удалив остатки препаратов и иммерсионного масла. Необходимо также удалить остатки иммерсионного масла с линзы объектива микроскопа. На рабочем месте наводится порядок. Полученные данные обсуждаются с преподавателем.

Отчет и выводы

В отчете по работе должны содержаться:

1. Калибровочная зависимость для используемого в микроспектрофотометре монохроматора (спектрографа ИСП-51).

2. Спектры поглощения центральных областей 2-х эритроцитов

3. Значения m в 30 эритроцитах, среднее значениеm; стандартная ошибка определенияm (эти сведения приводятся в форме mSD, гдеSD- стандартная ошибка).

4. Гистограмма распределения эритроцитов по содержанию в них оксигемоглобина.

В выводах обсуждается следующее:

1. К какому типу устройств относится монохроматор микроспектрофотометра?

2. Какой хромофор преимущественно определяет поглощение эритроцитов в области 400-450 нм?

3. Каково среднее значение содержания гемоглобина в одном эритроците и какова ошибка определения этого показателя?

4. Является ли исследованная клеточная популяция однородной?