Определение количества поглощающего свет вещества в микрообъектах методом фотометрирования в двух полях.

Задачей количественного микрофотометрического анализа является определение количества хромофора в исследуемом объекте. Однако микрообъекты нередко имеют сложную, неправильную форму, осложняющую решение этой задачи. Для ее решения обычно применяется так называемое фотометрирование в двух полях. Рассмотрим следующую ситуацию: имеется объект неправильной формы (рис. 2), передняя и задняя поверхности которого - параллельные друг другу плоскости, а распределение хромофора по площади объекта равномерно. Если фотометрировать этот объект при такой площади области регистрации, которая заведомо меньше площади самого объекта (S₁на рис. 2), то будет выполняться закон Бугера-Ламберта-Бера:

Эта же оптическая плотность будет характеризовать и любой остальной участок исследуемого объекта. Учитывая, что С=m/V(гдеС– молярная концентрация вещества,m– его масса в молях, аV– объем объекта в литрах), аV = Sl(поскольку объект имеет плоскопараллельную форму), можно преобразовать данное уравнение следующим образом:

Таким образом, масса m хромофора в объекте может быть определена по формуле:

Из входящих в правую часть выражения (1) величин неизвестна только S. На ее измерение и будут направлены дальнейшие усилия.

Увеличим площадь фотометрируемой области до размеров, больших, чем размер исследуемого объекта (S₂ на рис. 2,S₂>S). Светопропускание объектаT₂ при такой регистрируемой площади будет равно:

Т₁ в этом выражении – светопропускание на участкеS₁;D₁=-lg(T₁). Из выражения (2) получаем:

;

;

.

Отсюда (см. (1)) следует, что искомая масса хромофора m может быть рассчитана по формуле:

Практическая часть

Цель настоящей работы состоит в практическом изучении приборов и методов микроспектрофотометрии. Для этого в ходе выполнения работы регистрируются спектры поглощения отдельных эритроцитов и методом фотометрирования в двух полях определяется среднее содержание оксигемоглобина в эритроцитарных клетках.

Приборы и принадлежности:

1. Микроспектрофотометр

2. Набор предметных и покровных стекол для микроскопа.

3. Раствор NaCl(5%)

4. Эритроциты кролика

5. Иммерсионное масло

Устройство микроспектрофотометра.Микроспектрофотометр собран на базе микроскопа МБД-1 и спектрографа ИСП-51 (используемого в качестве монохроматора). Схема прибора приведена на рис. 3.

Основным источником света является лампа накаливания с йодным циклом, которая питается через понижающий трансформатор (1). Излучение лампы с помощью линзового конденсора (2) фокусируется на входной щели (3) ИСП-51 (4). В фокальной плоскости спектрографа установлена раздвижная щель (5), что делает возможным использование спектрографа в качестве монохроматора. Выходящий из спектрографа монохроматический пучок излучения после прохождения каллимирующей линзы (6) с помощью системы поворотных зеркал (7-9) направляется на микроконденсор микроскопа (10). Этот микроконденсор фокусирует излучение на объекте (11). Прошедшее через объект излучение с помощью объектива (12) и окуляра (13) направляется в микрофотонасадку МФН-2. Линза фотонасадки (14) совместно с объективом и окуляром микроскопа создают действительное увеличенное изображение объекта. В плоскости этого изображения установлена ирисовая диафрагма (15), диаметр отверстия которой может изменяться в пределах 114 мм. За этой линзой расположен фотодетектор (ФЭУ-35, 16). Сигнал с фотодетектора регистрируется цифровым рН-метром ОР-211 (17), работающим в режиме милливольтметра. Питание ФЭУ осуществляется высоковольтным выпрямителем-стабилизатором ВС-22 (18). Перед линзой фотонасадки (14) имеется фотозатвор (19).

Выходящий из окуляра микроскопа свет может направляться либо на фотодетектор, либо (если в световой поток введена поворотная призма (20)) в зрительную трубу. Объектив этой трубы (21) создает изображение объекта в плоскости расположения координатной сетки (22). Наблюдение сетки и изображения производится с помощью окуляра зрительной трубы (23). Координатная окулярная сетка состоит из прямоугольника и 4 штрихов. Она необходима для того, чтобы добиваться хорошей фокусировки изображения объекта и ориентироваться в поле зрения. Сетка установлена таким образом, что четкое изображение в ее плоскости соответствует четкому изображению объекта на диафрагме (15).

Фотозатвор фотонасадки в данном случае выполняет функции шторки фотодетектора. Привод фотозатвора осуществляется с помощью специальной спусковой скобы, расположенной на обратной стороне микроскопа, на фотонасадке. Если фотозатвор закрыт, в пучке света находится поворотная призма (20), направляющая свет в зрительную трубу. При открывании фотозатвора призма выводится из пучка, и свет направляется на фотодетектор.

Реальное увеличение изображения объекта рассчитывается по формуле:

Где Г – общее увеличение; Г_об– увеличение объектива (при максимальном увеличении используется 90-кратный иммерсионный объектив); Г_ок– увеличение окуляра (используется 15-кратный окуляр), а 1,12 – увеличение линзы фотонасадки.

Задание 1. Регистрация калибровочной зависимости для используемого в работе монохроматора (спектрографа ИСП-51).

Шкала изменения длины волны спектрографа ИСП-51 (ручка развертки со шкалой расположена за микроскопом справа) проградуирована в условных единицах и не позволяет прямо установить, излучение с какой длиной волны в настоящий момент выходит из выходной щели прибора. Для того, чтобы перевести условные единицы шкалы развертки в длины волн, требуется построение калибровочной зависимости, т.е. зависимости между положением ручки развертки монохроматора и длиной волны излучения на выходной щели прибора. По виду этой зависимости («калибровки») можно судить о типе монохроматора: если монохроматор дифракционный (в качестве активного элемента используется дифракционная решетка), калибровка будет линейной, если же монохроматор призменный (в качестве активного элемента используется преломляющая призма) – то нелинейной.

Для построения калибровочных зависимостей монохроматоров удобно использовать источники излучения с линейчатыми спектрами испускания. У таких источников почти все излучение сосредоточено в так называемых спектральных линиях, полуширина которых относительно невелика. Большинство источников с линейчатыми спектрами испускания излучают света за счет дугового электрического разряда в парах металлов (используется явлениеэлектролюминесценции). Поскольку структура электронных энергетических уровней в атомах каждого конкретного металла постоянна и хорошо исследована в большинстве случаев, известно точное спектральное положение каждой из излучаемых источником данного типа линий. Самым распространенным источником с линейчатым спектром испускания являютсяртутно-кварцевые лампы. Именно такой источник, ртутно-кварцевая лампа высокого давления ДРК-120, используется для получения калибровочной зависимости монохроматора и в данной работе.

Порядок проведения работы

1. Установить лампу ДРК-120 вместо стандартного источника света перед входной щелью монохроматора.

2. Включить ртутно-кварцевую лампу, вставив вилку блока ее питания в сетевую розетку. Излучение лампы достигает максимальной интенсивности только после ее прогрева, занимающего от 3 до 5 минут. Признаком выхода лампы на рабочий режим является стабилизация величины протекающего через нее электрического тока, регистрируемого имеющимся на блоке питания амперметром.

Внимание! Ртутно-кварцевая лампа ДРК-120 является высокоинтенсивным источником ультрафиолетового излучения! Категорически запрещается заглядывать в тубус кожуха лампы, направлять ее излучение на людей и оборудование практикума, извлекать включенную лампу из защитного кожуха, включать лампу вне защитного кожуха. При работе с лампой следует защищать глаза и неприкрытые одеждой участки кожи от повреждения избыточным ультрафиолетовым излучением. Кожух лампы во время работы сильно нагревается. Во избежание ожогов следует избегать соприкосновений с ним без специальных мер предосторожности.

3. Фокусировать излучение лампы на входной щели монохроматора. При правильной фокусировке на входной щели должно быть видно четкое изображение баллона лампы.

4. Установить ручку развертки спектра монохроматора таким образом, что на шкале развертки было 23 условных единицы. Медленно прокручивая ручку вперед и назад, добиться того, чтобы на выходной щели прибора появилась яркое зеленое излучение.

5. Установить в оптическую систему микроскопа обзорный объектив (увеличение 10). Убедиться в том, что затвор фотонасадки закрыт, и в зрительной трубе видно изображение.

6. С помощью трех поворотных зеркал и регулировки резкости добиться появления в поле зрения четкого и максимально яркого изображения выходной щели монохроматора. При правильной настройке хорошо видно, что излучение источника имеет линейчатый характер.

7. Вращая ручку развертки спектра монохроматора, разместить наблюдаемую линию в определенном положении относительно ориентировочных штрихов сетки. Записать показания шкалы развертки.

8. Перенастроить ручку развертки монохроматора таким образом, что на шкале развертки было 25 условных единицы.

9. Медленно поворачивая ручку развертки спектра монохроматора в сторону меньших значений, добиться появления в поле зрения яркой желтой линии. Поместив эту линию в ранее найденном положении в поле зрения, записать показания шкалы развертки спектрографа. Повторять процедуру в интервале значений шкалы развертки от 25 до 8 условных единицы, регистрируя положение по этой шкале каждой видимой линии излучения. При хорошей настройке регистрируются следующие линии: (1) яркая и широкая желтая линия. Это дуплетная линия, состоящая из двух близкорасположенных спектрально полос излучения с длинами 577 и 579 нм. На данном монохроматоре эти две полосы не разрешаются, поэтому линия видна как одна широкая полоса. Ее длину волны можно принять за 578 нм. (2) Яркая зеленая линия. Длина волны 546 нм. (3) Относительно слабая линия зеленовато-голубого цвета (цвета «морской волны»). Длина волны 492 нм. (4) Яркая сине-фиолетовая линия. Длина волны 436 нм. (5). Темно-фиолетовая линия. Эта линия достаточно яркая, но плохо регистрируется зрительно, поскольку близка к коротковолновой границе области зрительного восприятия. Как и линия желтого цвета, данная линия – дуплетная, и состоит из двух полос излучения с длинами волн 403 и 405 нм. Однако более длинноволновая компонента этого дуплета в 10 раз ярче коротковолновой, и именно она обычно видна.

10. С помощью программы «Exel» построить калибровочную зависимость для ИСП-51. При этом следует иметь в виду, что независимой переменной (аргументом) на калибровочной зависимости являются показания шкалы развертки монохроматора, а длина волны излучения, попадающего на выходную щель прибора – этофункцияположения ручки развертки. На основании внешнего вида полученной калибровки установить, какое оптическое устройство в ИСП-51 разлагает излучение источника света на его спектральные составляющие.

Задание 2. Регистрация спектров поглощения центральной части отдельных эритроцитов.

Порядок проведения работы

1. Выключить лампу ДРК-120, выдернув вилку источника ее питания из сетевой розетки. Внимание: При удалении вилки питания из сетевой розетки следует делать это, держась за корпус вилки, а не за сетевой шнур.

2. Вместо этой лампы установить перед входной щелью монохроматора исходный источник излучения – лампу накапливания с йодным циклом. Включить источник питания лампы накаливания (тумблер включения находится на его передней панели). Напряжение питания должно составлять около 13 В. Если оно не соответствует этому значению, изменить напряжение питания встроенным в источник питания латером (трансформатором с регулируемым выходным напряжением, регулирующая ручка находится на блоке питания сверху). Контроль за напряжением питания лампы осуществляется с помощью вольтметра, имеющегося на передней панели источника.

3. Фокусировать излучение лампы на входной щели монохроматора. При правильной фокусировке на входной щели должно быть видно четкое изображение баллона лампы.

4. Настроить монохроматор на пропускание излучения в зелёной области спектра (540-550 нм).

5. Установить в оптическую систему микроскопа обзорный объектив (увеличение 10). Убедиться в том, что затвор фотонасадки закрыт, и в зрительной трубе видно изображение.

6. С помощью трех поворотных зеркал и регулировки резкости микроскопа добиться появления в поле зрения четкого и максимально яркого изображения выходной щели монохроматора. Имейте в виду, что, чем ярче будет видимое свечение, тем легче и проще будет проведение измерений. Это связано с тем, что глаз регистрирует поток излучения с поля зрения, а при большом увеличении реальная площадь поля зрения очень мала, соответственно, очень мал будет и поток света с этой площади. Для компенсации этого эффекта необходимо добиваться, чтобы на объект попадало излучение максимально высокой интенсивности.

7. Приготовить суспензию эритроцитов кролика в 5% растворе NaCl. Концентрация клеток в суспензии должна быть не менее 0,5% (что соответствует разведению эритроцитов цельной крови примерно в 100 раз). Поскольку исследуются отдельные клетки, очень высокой точности разведения в данном случае не требуется.

8. Приготовить препарат эритроцитарной суспензии для исследования. Для этого в центр чистого предметного стекла поместить 1 каплю эритроцитарной суспензии. Накрыть эту каплю покровным стеклом. Осторожно, надавливая на только на углы покровного стекла вне потенциальной области наблюдения, прижать покровное стекло к предметному. Излишки эритроцитарной суспензии, выступающие по краям покровного стекла, удалить с помощью фильтровальной бумаги.

9. Установить приготовленный препарат в держатели предметного столика микроскопа. Регулируя резкость изображения, постараться увидеть эритроциты в поле зрения при малом увеличении микроскопа (объектив - 10).

10. Если клетки хорошо заметны при малом увеличении, можно перейти на большое. Для этого на центр поля зрения наносится 1 капля иммерсионного масла, а в качестве рабочего объектива микроскопа устанавливается иммерсионный объектив (увеличение 90, отличается наличием полоски черного цвета на корпусе). С помощью ручки настройки резкости иммерсионный объектив медленно приближается к исследуемому объекту до тех пор, пока его нижняя линза не коснется поверхности капли иммерсионного масла. После этого объектив слегка приподнимается, но масляный «столбик» между поверхностью объекта и объективом при этом разрывать нельзя. Регулируя резкость (следует быть очень осторожным и избегать резких движений), добиться появления четкого изображения эритроцитов в поле зрения. При правильной настройке резкости эритроциты должны быть заметнотемнееокружающего фона.

11. Включить систему регистрации сигналов микроспектрофотометра: (1) включить регистрирующий рН-метр (сетевая кнопка расположена на задней панели прибора); (2) включить источник питания ФЭУ (ВС-22, расположен внизу, при включении сначала слева внизу передней панели включается тумблер «Сеть», а через 3-4 минуты – справа вверху тумблер «Выход»). Если после подачи высокого напряжения на ФЭУ показания рН-метра не равны 0, с помощью регулировочной ручки «Std1» на передней панели добиться того, чтобы они приняли это значение.

12. Установить минимальный размер диафрагмы спектрофотометра, сдвинув регулировочную ручку (расположена спереди, непосредственно перед кожухом ФЭУ) в крайнее правое положение.

13. Ориентируясь с помощью координатных штрихов, поместить в поле «зрения» фотодетектора участок объекта, заведомо не содержащий клеток. Открыть шторку фотозатвора, зарегистрировать величину фотосигнала. При хорошей настройке прибора фотосигнал должен быть не менее 200 мВ. Если он меньше, следует либо увеличить чувствительность ФЭУ, либо повторить выполнение пунктов с 5 по 10. Следует иметь в виду, что увеличение чувствительности ФЭУ автоматически повышает уровень шумов.

14. Закрыть шторку фотозатвора. Поместить в поле «зрения» ФЭУ эритроцит. Удобно использовать не единичные клетки, а эритроцитарные агрегаты, которые обычно имеются на препарата. Место проекции диафрагмы фотонасадки на поле зрения микроскопа обозначено на рис. 4.

15. Откройте шторку фотозатвора. Зарегистрируйте фотосигнал. Если эритроцит (или один из эритроцитов эритроцитарного) агрегата попал в поле «зрения» ФЭУ, величина фотосигнала будет значимо, на 30-40%, меньше фонового.

16. Не закрывая шторки фотозатвора, перенастройте монохроматор на пропускание излучения с длиной волны 450 нм (примерно 12 условных единиц по шкале развертки спектра), зарегистрируйте сигнал. Далее сигнал регистрируется в ходе пошагового уменьшения длины волны тестирующего излучения вплоть до 400 нм. Шаг уменьшения должен составлять не более 0,5 условных единиц шкалы развертки монохроматора. Полученный ряд значений отражает зависимость светового потока через эритроцит (J) от длины волны тестирующего излучения.

17. Закрыть шторку фотозатвора. Наблюдая поле зрения в зрительную трубу, увеличивать длину волны тестирующего излучения до тех пор, пока изображение исследуемой клетки не станет достаточно хорошо заметно. Убедиться в том, что исследуемый эритроцит не сдвинулся с того месте, на которое был ранее установлен. Если этого не произошло, сдвинуть эритроцит в сторону таким образом, чтобы в поле «зрения» ФЭУ оказался заведомо свободный от клеток участок поля. Повторить выполнение пункта 16. Полученный ряд значений фотосигнала отражает зависимость фонового светового потока (J₀) от длины волны тестирующего излучения. Естественно, если измерения были проведены правильно, на каждой из длин волн излученияJ₀ должно бытьбольшеJ.

18. Повторить измерения зависимостей J иJ₀ от длины волны для другого эритроцита.

19. Используя программу «Exel», построить спектры поглощения для центральных зон двух эритроцитов (напомним, что спектр поглощения – зависимость оптической плотности объектаDот длины волны тестирующего излучения).