лучаютсяпутемковалентноймодификацииобычныхнуклеотидовпослеихвключениявцепьРНК.Два других типа модифицированных нуклеотидов изображены на рис. 6.43. В большинстве молекул тРНК около10%нуклеотидовпредставленымодифицированнымивариантами(см.рис.6.52).
этой тРНК. Распознавание и связывание правильной аминокислоты зависит от фер-
которые ковалентно присоединяют каждую аминокислоту к соответствующим ей молекулам тРНК (рис. 6.56 и 6.57). В большинстве клеток для каждой аминокислоты имеется отдельный фермент синтетаза (то есть всего 20 различных синтетаз); одна прикрепляет глицин ко всем тРНК, которые узнают кодоны, задающие глицин; другая — аланин ко всем тРНК, которые узнают кодоны для аланина, и так далее. Однако многие бактерии имеют менее 20 синтетаз, и один и тот же фермент синтетаза отвечает за прикрепление более чем одной аминокислоты к соответствующим тРНК. В подобных случаях одна синтетаза размещает идентичную аминокислоту на тРНК двух разных типов, только одна из которых имеет антикодон, который соответствует данной аминокислоте. Затем второй фермент химически модифицирует каждую «ошибочно» присоединенную аминокислоту, так что она приводится в соответствие антикодону той тРНК, с которой ковалентно связана.
Катализируемая синтетазой реакция, в ходе которой аминокислота присоединяется к 3′-концу тРНК, есть одна из многих реакций, сопряженных с высвобождающим энергию гидролизом ATP (см. стр. 125–126), в результате которой образуется высокоэнергетическая связь между тРНК и аминокислотой. Энергия этой связи используется на более позднем этапе, в синтезе белка, для ковалентного связывания аминокислоты с наращиваемой полипептидной цепью.
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 569
Рис.6.56.Активацияаминокислот.Аминокислотаактивируетсядлясинтезабелкаферментомаминоацил- тРНК-синтетазойвдваэтапа.Какпоказанонасхеме,всеаминокислотыприсоединяютсяксвоиммолекулам тРНКвысокоэнергетическойсвязьюзасчетэнергиигидролизаATP.Аминокислотасначалаактивируется путемпрямогосоединенияеекарбоксильнойгруппысозвеномАMPсобразованиемаденилированной аминокислоты;связываниесАMP,обычнонеблагоприятнаяреакция,осуществляетсязасчетгидролиза молекулы ATP, которая и отдает АMP. Не оставляя фермент синтетазу, связанная с АMP карбоксильная группа аминокислоты затем переносится на гидроксильную группу сахара на 3' конце молекулы тРНК. ПосредствомтакогопереносааминокислотачерезактивированнуюэфирнуюсвязьприсоединяетсяктРНК иобразуетмолекулуаминоацил-тРНК.Ферментсинтетазанепоказаннаэтойсхеме.
Рис. 6.57. Структура связи в комплексе аминоацил–тРНК. Карбоксильный конец аминокислоты образует эфирнуюсвязьсрибозой.Посколькугидролизэтойэфирнойсвязисопряженсбольшимблагоприятнымизменением свободной энергии, то аминокислота, удерживаемая таким образом, как говорят, активируется. а)Схематичноеизображениеструктуры.Аминокислотасвязанаснуклеотидомна3'-концемолекулытРНК(см. рис.6.52).б)Фактическаяструктура,соответствующаяизображениюа.Известнодваглавныхклассафермен- товсинтетаз:однисвязываютаминокислотунепосредственносгруппой3'-OHрибозы,адругиесвязываютеесначаласгруппой2'-OH.Впоследнемслучаеаминокислотапередвигаетсявположение3'входепоследующейреакциитрансэтерификации.Какинарис.6.56,«R-группа»обозначаетбоковуюцепьаминокислоты.
570 Часть 2. Основные генетические механизмы
Ферменты аминоацил-тРНК-синтетазы и молекулы тРНК одинаково важны в процессе декодирования (рис. 6.58). Это было установлено при помощи эксперимента, в ходе которого одна аминокислота (цистеин) была химически преобразована в другую аминокислоту (аланин) после того, как она уже была присоединена к специфичной ей тРНК. Когда молекулы таких «гибридных» аминоацил-тРНК были использованы для синтеза белка в бесклеточной системе, неправильная аминокислота была вставлена во всех точках цепи белка, в которых та тРНК была использована. Хотя, как мы увидим, клетки имеют несколько механизмов проверки качества, чтобы избежать такого рода неполадок, экспериментальные данные свидетельствуют о том, что генетический код транслируется двумя наборами посредников, работающих последовательно один после другого. Каждый из них
сбольшой специфичностью приводит в соответствие поверхность одной молекулы
споверхностью другой, и именно через их совместное действие пролегает связь между каждой последовательностью из трех нуклеотидов в молекуле мРНК — то есть каждого кодона — и специфической для него аминокислотой.
Несколько механизмов, работающих вместе, гарантируют, что тРНК-синтетаза связывает каждую тРНК с верной аминокислотой. Сначала синтетаза должна выбрать правильную аминокислоту — и у большинства синтетаз для этого задействован двухступенчатый механизм. Во-первых, правильная аминокислота имеет наиболее высокое сродство к «карману» активного участка своей синтетазы, а посему предпочитается остальным 19-ти. В частности, аминокислоты, которые крупнее надлежащей, эффективно изымаются из активного участка. Однако точно различить между собой две подобные аминокислоты, такие как изолейцин и валин (которые отличаются только метильной группой), весьма проблематично для одно-
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 571
ступенчатого механизма распознавания. После того как аминокислота ковалентно связана с АМP, происходит второй этап «опознания» (см. рис. 6.56). Когда тРНК связывается с синтетазой, она пытается втолкнуть аминокислоту во второй карман синтетазы, точные размеры которого исключают правильную аминокислоту, но допускают введение близкородственных аминокислот. Как только аминокислота попадает в этот «редактирующий карман», ее связь с АМР гидролизуется (или связь с самой тРНК, если связь аминоацил-тРНК уже образовалась к тому времени) и она высвобождается из фермента. Такое гидролитическое редактирование, которое похоже на экзонуклеолитическую корректировку, осуществляемую ДНК-полимеразами (рис. 6.59), повышает общую точность «заправки» тРНК приблизительно до одной ошибки на 40 000 образованных связей.
тРНК-синтетаза должна также распознавать набор верных тРНК, и значительная структурная и химическая комплементарность между синтетазой и тРНК позволяет
Рис. 6.60. Узнавание молекулы тРНК ее ами- ноацил-тРНК-синтетазой. В приведенной здесь тРНК(тРНКGln)специфическиенуклеотидыивантикодоне(внизу),ивакцептирующемаминокислотуплечепозволяютферментусинтетазе(синяя) опознатьеекакправильнуютРНК.Связаннаямолекула ATP окрашена в желтый цвет. (За иллюстрациюблагодаримTomSteitz.)
синтетазе распознавать соответствующие ей тРНК по ряду характерных признаков (рис. 6.60). В большинстве своем тРНК-синтетазы непосредственно узнают соответствующий антикодон тРНК; такие синтетазы содержат три смежных нуклеотид-связывающих кармана, каждый из которых по форме и заряду комплементарен нуклеотиду в антикодоне. Для других синтетаз ключевым элементом узнавания служит последовательность нуклеотидов акцепторного стебля. Однако в боль-
шинстве случаев синтетаза «считывает» нуклеотиды в нескольких различных позициях тРНК.
6.2.6. Аминокислоты присоединяются к C-концу наращиваемой полипептидной цепи
Теперь, зная, что аминокислоты сначала присоединяются к молекулам тРНК, мы можем обратить наш взор на механизм, который соединяет аминокислоты друг с другом на определенном этапе создания белка. Фундаментальная реакция синтеза белка — образование пептидной связи между карбоксильной группой на конце наращиваемой полипептидной цепи и свободной аминогруппой подошедшей аминокислоты. Следовательно, белок синтезируется последовательно в направлении от N конца к С-концу. В течение всего процесса наращиваемый карбоксильный конец полипептидной цепи остается активированным благодаря его ковалентной связи с молекулой тРНК (образуя пептидил-тРНК). Присоединение очередной аминокислоты разрушает эту ковалентную высокоэнергетическую связь, но незамедлительно заменяет ее тождественной связью на аминокислоте, добавленной самой последней (рис. 6.61). Таким образом, каждая присоединяемая аминокислота снабжена энергией активации, необходимой для присоединения следующей аминокислоты, а не для собственного присоединения — пример полимеризации по типу «наращивания с головы», описанному на рис. 2.68.
6.2.7. Записанная в мРНК информация расшифровывается в рибосомах
Синтез белков осуществляется в соответствии с информацией, которую несут молекулы мРНК. Чтобы поддерживать правильную рамку считывания и гаран-
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 573
Рис. 6.61. Включение аминокислоты в белковую цепь. Полипептидная цепь растет путем последова-
тельногоприсоединенияаминокислоткееС-концу.Образованиекаждойпептиднойсвязиэнергетически благоприятно,потомучтонаращиваемыйC-конецзаранееактивированковалентнымприсоединением молекулытРНК.Связьпептидил-тРНК,котораяактивируетрастущийконец,регенерируетсявходекаж- дого акта присоединения. Боковые цепи аминокислот обозначены знаками R1, R2, R3 и R4; в качестве ориентиравзятавтораяаминокислотаполипептиднойцепи,всеатомыкоторойоттененысерымфоном. Нарисункеизображеноприсоединениечетвертойаминокислоты(красной)крастущейцепи.
тировать точность (примерно 1 ошибка на каждые 10 000 аминокислот), синтез белка происходит в сложной каталитической машине — рибосоме (ribosome), состоящей из более чем 50-ти различных белков — рибосомных белков (ribosomal proteins) — и нескольких молекул РНК — рибосомных РНК (рРНК; ribosomal RNA). Типичная клетка эукариот содержит миллионы рибосом в цитоплазме (рис. 6.62). Субчастицы рибосом эукариот собираются в ядрышке, когда новотранскрибированные и модифицированные рРНК связываются с рибосомными белками, которые заблаговременно переносятся в ядро после их синтеза в цитоплазме. За-
Рис. 6.62. Рибосомы в цитоплазме эукариотической клетки. На этом электронном микрофотоснимке показан тонкий срез небольшой области цитоплазмы. Рибосомы выглядят как черные точки (указаны краснымистрелками).Однисвободноплаваютвцитозоле;другиепривязаныкмембранамэндоплазматическойсети.(ЗаприсланныймикрофотоснимокотвсейдушиблагодаримDanielS.Friend.)
574 Часть 2. Основные генетические механизмы
тем две рибосомные субчастицы экспортируются в цитоплазму, где объединяются в одно целое и начинают синтезировать белки.
Рибосомы эукариот и прокариот имеют подобное строение и функции. И те и другие состоят из одной большой и одной малой субчастиц, которые подогнаны одна к другой и образуют рибосому массой несколько миллионов дальтон (рис. 6.63). Малая субчастица служит каркасом, на котором молекулы тРНК могут быть точно сопоставлены с кодонами мРНК (см. рис. 6.58), тогда как большая субчастица катализирует образование пептидных связей, которыми аминокислоты соединяются между собой, образуя полипептидную цепь (см. рис. 6.61).
Рис. 6.63. Сравнение рибосом прокариот и эукариот. Несмотря на различия в числе и размере рРНК и белков, входящих в состав рибосом прокариот и эукариот, рибосомы имеют почти одинаковую структуруиработаютподобнымобразом.Хотямолекулы18Sи28SрРНКрибосомыэукариотсодержат многонуклеотидов,отсутствующихуихбактериальных«коллег»,этинуклеотидыприсутствуютввиде множественных вставок, которые образуют дополнительные домены и особо не изменяют базовую структурурРНК.
Если рибосома не занята активным синтезом белков, то обе ее субчастицы отделены одна от другой. Они объединяются друг с другом на молекуле мРНК, обычно около ее 5′-конца, — чтобы начать синтез белка. Далее мРНК протягивается сквозь рибосому; по мере того как ее кодоны входят в сердцевину (кор) рибосомы, последовательность нуклеотидов мРНК транслируется в последовательность аминокислот, используя в качестве адаптеров тРНК, которые на конце наращиваемой полипептидной цепи устанавливают все аминокислоты в правильной последовательности. Когда попадается стоп-кодон, рибосома высвобождает завершенный
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 575
белок и две ее субчастицы вновь отделяются одна от другой. Эти субчастицы могут быть использованы в дальнейшем — чтобы начать синтез какого-либо иного белка на какой-нибудь другой молекуле мРНК.
Рибосомы работают с замечательной эффективностью: за одну секунду одна эукариотическая рибосома присоединяет к полипептидной цепи примерно 2 аминокислоты; рибосомы бактериальных клеток работают еще быстрее: со скоростью около 20 аминокислот в секунду. Как рибосоме, подобно искуснейшему балетмейстеру, удается скоординировать множество действий, необходимых для эффективной трансляции? Рибосома содержит четыре участка связывания молекул РНК: один предназначен для мРНК, а три (названные A-сайтом, P-сайтом и E-сайтом) — для молекул тРНК (рис. 6.64). Молекула тРНК прочно удерживается в А- и P-сайтах, только если ее антикодон образует комплементарные пары оснований с кодоном
итриучасткасвязываниятРНК:А-,P-иE-сайты(соответственносокращенияназваний:аминоацил тРНК(А), пептидил-тРНК (P), и выход (E; по-англ. выход — exit. — Прим. перев.)). а) Бактериальная рибосома, обращенная малой субчастицей к читателю (темно-зеленая), а большой субъединицей — от него (светло-зеленая). Показаны и молекулы рРНК, и рибосомные белки. Молекулы тРНК показаны свя- заннымивE-участке(красная),P-участке(оранжевая)иA-участке(желтая).Хотяздесьвсетриучастка связывания тРНК показаны занятыми, в ходе процесса синтеза белка не более двух из этих участков, как думают, содержат молекулы тРНК в каждый момент времени (см. рис. 6.66). б) Большая и малая субчастицы рибосомы, расположенные так, как если бы рибосома на изображении а была раскрыта как книга. в) Рибосома с изображения а, повернутая на 90° и обращенная большой субчастицей вверх
ималой—вниз.г)Схематичноепредставлениерибосомы(втойжеориентации,чтоинавидев,которое будет использовано в последующих рисунках). (Изображения а, б, и в переработаны из M. M. Yusupov et al., Science 292: 883–896, 2001. С любезного разрешения издательства AAAS; выражаем свою благо-
дарностьAlbionBaucomиHarryNoller.)
576 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.6.65.ПутьмРНК(синяя)черезмалуюсубча-
стицурибосомы.Ориентациятаже,чтоинаправомизображениирис.6.64,б.(БлагодаримHarry F. Noller,рисунокоснованнаданныхизG. Z. Yusopova et al., Cell 106: 233–241, 2001. С любезного разрешенияиздательстваElsevier.)
(с допуском «раскачиваний») на молекуле мРНК, протягиваемой сквозь рибосому (рис. 6.65). А- и P-участки расположены достаточно близко друг к другу, так что обе втиснутые в них молекулы тРНК могут образовать комплементарные пары оснований с двумя смежными кодонами на молекуле мРНК. Эта особенность рибосомы позволяет придерживаться верной рамки считывания на мРНК.
Сразу после инициации синтеза белка каждая новая аминокислота добавляется к растущей цепи в цикле реакций, состоящем из четырех основных
шагов: связывание тРНК, образование пептидной связи, транслокация (перемещение) большой субчастицы и транслокация малой субчастицы. В результате двух шагов транслокации вся рибосома передвигается по мРНК на три нуклеотида и готова начать следующий цикл (рис. 6.66). Наше описание процесса элонгации цепи начинается с того момента, когда несколько аминокислот уже связано друг с другом и в P-сайте рибосомы находится молекула тРНК, ковалентно связанная с концом растущего полипептида. На шаге 1 тРНК, несущая следующую аминокислоту для цепи, связывается с A-участком рибосомы, образуя пары оснований с размещенным там кодоном мРНК, так что P- и A-сайты содержат смежно связанные тРНК. На шаге 2 карбоксильный конец полипептидной цепи освобождается от тРНК в P-сайте (путем разрыва высокоэнергетической связи между тРНК и ее аминокислотой) и соединяется со свободной аминогруппой аминокислоты, связанной с тРНК в A-сайте, образуя новую пептидную связь. Эта определяющая синтез белка реакция катализируется пептидилтрансфера- зой (peptidyl transferase), входящей в состав большой субчастицы рибосомы. На шаге 3 большая субчастица смещается относительно мРНК, удерживаемой малой субчастицей, и таким образом переводит акцепторные стебли двух молекул тРНК в E- и P-сайты большой субчастицы. На шаге 4, в результате очередной цепочки конформационных изменений, малая субчастица и связанная с ней мРНК перемещаются в точности на три нуклеотида, благодаря чему рибосома приходит в исходное состояние и может принять следующую аминоацил-тРНК. Далее повторяется шаг 1 с новоподошедшей молекулой аминоацил-тРНК и весь процесс повторяется.
Такой четырехэтапный цикл повторяется всякий раз, когда аминокислота добавляется к полипептидной цепи, — по мере того как цепь растет от амино- к карбоксильному концу.
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 577
Рис.6.66.ТрансляциямолекулымРНК.Каждаяаминокислота,присоединяемаякконцуполипептидной цепи, выбирается путем комплементарного спаривания оснований между антикодоном на связанной снеюмолекулетРНКиследующимкодономвцепимРНК.Посколькупаруоснованийскаждымотдельно взятым кодоном может образовать молекула тРНК только одного из многих типов тРНК, находящихся
вклетке,кодонопределяетконкретнуюаминокислоту,котораябудетдобавленакнаращиваемойполипептиднойцепи.Представленныйнасхемечетырехступенчатыйциклповторяетсясноваиснованапротяжении синтеза белка. На этапе 1 молекула аминоацил-тРНК связывается со свободным A-участком рибосомы,аиспользованнаямолекулатРНКвысвобождаетсяизE-участка.Наэтапе2образуетсяновая пептидная связь. На этапе 3 большая субчастица смещается относительно малой (транслоцируется),
всилу чего обе молекулы тРНК оказываются в гибридных участках: одна — в P большой субчастицы
иАмалой;вторая—вEбольшойсубчастицыиPмалой.Наэтапе4малаясубчастицатранслоцируется по рибосоме, увлекая за собой и связанную с ней мРНК, на расстояние трех нуклеотидов. Данный шаг «переустанавливает» рибосому с пустым A-сайтом в состояние готовности к связыванию следующей молекулы аминоацил-тРНК. Как обозначено на схеме, мРНК транслируется в направлении 5' → 3',
исначала синтезируется N-концевая часть белка, а в каждом последующем цикле одна аминокислота добавляетсянаC-конецполипептиднойцепи.
6.2.8. Факторы элонгации продвигают трансляцию и повышают ее точность
Основной цикл удлинения полипептида, изображенный в общих чертах на рис. 6.66, имеет еще одну особенность, благодаря которой трансляция осуществляется особенно эффективно и точно. Два фактора элонгации входят в рибосому и покидают ее в ходе каждого цикла: каждый из них гидролизует GTP до GDP, пре-
