508 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 6.2. Путь от ДНК к белку. Поток генетической информацииотДНКкРНК(транскрипция)иотРНКкбелку (трансляция)бурлитвовсехживыхклетках.
кодируемых геномом, мы знаем, что конечным продуктом многих генов является РНК. Подобно белкам, многие из таких РНК сворачиваются в точные трехмерные структуры, которые выполняют структурные, каталитические
и регуляторные функции в клетке. Мы начинаем эту главу с первого эта-
па процесса расшифровки генома: с транскрипции, в ходе которой из геномной ДНК образуется молекула РНК. Затем мы просле-
дим за судьбой этой молекулы РНК в клетке и завершим наш путь на молекуле правильно свернутого белка. В конце главы мы поговорим о том, каким образом могла принятая
ныне весьма сложная схема хранения, транскрипции и трансляции информации возникнуть на базе более простых систем, существовавших на самых ранних этапах эволюции клетки.
6.1. От ДНК к РНК
Транскрипция и трансляция — средства, которыми клетки считывают и экспрессируют генетические инструкции, записанные в генах. Поскольку с одного и того же гена может быть «изготовлено» множество тождественных копий РНК, а каждая молекула РНК может направлять синтез многочисленных идентичных молекул белка, клетки в случае необходимости могут быстро синтезировать большое количество белка. Но каждый ген может, кроме того, транскрибироваться и транслироваться с различной эффективностью, что позволяет клетке делать огромные количества некоторых белков и ничтожно малые — других (рис. 6.3). Более того, как мы увидим в следующей главе, клетка может изменять (или регулировать) экспрессию каждого из своих генов согласно текущим потребностям — чаще всего путем управления «объемом выработки» соответствующей РНК.
6.1.1. Определенные части последовательности ДНК транскрибируются в молекулы РНК
Первый шаг, предпринимаемый клеткой для считывания своих генетических инструкций, состоит в копировании определенного участка нуклеотидной последовательности ДНК — гена — в нуклеотидную последовательность РНК. Содержащаяся в РНК информация, хотя и скопирована в иную химическую форму, по-прежнему записана, по сути, тем же языком, каким она была описана в ДНК, — языком последовательности нуклеотидов. Отсюда и название транскрипция (transcription).
Подобно ДНК, РНК представляет собой линейный полимер, состоящий из субъединиц нуклеотидной природы четырех различных типов, связанных друг с другом фосфодиэфирными связями (рис. 6.4). Химически она отличается от ДНК по двум параметрам: 1) нуклеотиды в РНК суть рибонуклеотиды, то есть они содержат сахар
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 509
Рис. 6.3. Гены могут экспрессироваться с разной эффективностью. В данном примере ген А транс-
крибируетсяитранслируетсянамногоболееэффективно,чемгенB.Этопозволяетклеткепроизводить белкаАнамногобольше,чембелкаB.
рибозу (отсюда название рибонуклеиновая кислота), а не дезоксирибозу; 2) хотя, подобно ДНК, РНК содержит основания аденин (A), гуанин (G) и цитозин (C), она содержит основание урацил (U) вместо тимина (T) в ДНК. Поскольку U, подобно T, может спариваться посредством водородных связей с А (рис. 6.5), постольку свойства комплементарного спаривания оснований, описанные для ДНК в главах 4 и 5, распространяются также и на РНК (в РНК G спаривается с C, а А спаривается с U). Мы находим также и другие типы пар оснований в РНК: например, G время от времени создает пару с U.
Хотя эти химические различия и незначительны, ДНК и РНК весьма сильно отличаются по общей структуре. Тогда как ДНК всегда находится в клетках в виде двухцепочечной спирали, РНК одноцепочечная. Поэтому цепь РНК может сложиться в определенную конфигурацию — точно так же как полипептидная цепь сворачивается в конечную форму белка (рис. 6.6). Как мы увидим позже в этой главе, способность сворачиваться в сложные трехмерные структуры позволяет некоторым молекулам РНК брать на себя требующие особой точности структурные и каталитические функции.
6.1.2. В результате транскрипции синтезируется РНК, комплементарная одной из цепей молекулы ДНК
Находящаяся в клетке РНК получена в ходе транскрипции ДНК — процесса, который в некотором роде подобен процессу репликации ДНК, рассмотренному нами в главе 5. Транскрипция начинается с раскрытия и раскручивания маленькой части двойной спирали ДНК — чтобы выставить наружу основания на обеих цепях ДНК. Затем одна из двух цепей двойной спирали ДНК используется как матрица для синтеза молекулы РНК. Как и при репликации ДНК, нуклеотидная последовательность цепи РНК определяется комплементарным спариванием оснований между поступающими нуклеотидами и матрицей ДНК. Когда обнаруживается хорошее
510 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 6.4. Химическая структура РНК. а) РНК содержит сахаррибозу,котораяотличаетсяотсахарадезоксирибозы,входящеговсоставДНК,наличиемдополнительной группы–ОН.б)РНКсодержитоснованиеурацил,который отличаетсяоттимина,эквивалентногооснованиявДНК, отсутствиемгруппы–CH3.в)КороткийотрезокРНК.Фос- фодиэфирные химические связи между нуклеотидами вРНКтакиеже,чтоивДНК.
Рис.6.5.Урацилобразуеткомплементарнуюпарусадени-
ном. Отсутствие метильной группы в U никак не влияет на спариваниеоснований;такимобразом,параоснованийU–A оченьпохожанапаруоснованийT–A(см.рис.4.4).
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 511
Рис. 6.6. РНК способна сворачиваться с образованием характерных структур. РНК по большей части одноцепочечная, но она часто содержит короткие участки нуклеотидов, которые могут образовывать классическиепарыоснованийскомплементарнымипоследовательностями,находящимисявкаком-либо ином месте той же самой молекулы. Такие взаимодействия, наряду с дополнительными взаимодействиями, возникающими между нетрадиционно спаренными основаниями, позволяют молекуле РНК сворачиватьсявтрехмернуюструктуру,котораяопределяется еенуклеотиднойпоследовательностью. а)СхемасвернутоймолекулыРНК,накоторойпоказанытольковзаимодействиямеждуклассическими парамиоснований.б)Структура,котораяобразованавзаимодействиемкакмеждуклассическикомплементарнымиоснованиями(красные),такимежду«нетрадиционными»(зеленые)парами.в)Структура нативнойРНК:частьинтронагруппыI(см.рис.6.36).Каждаяклассическаяпараоснованийобозначена «перекладиной»вдвойнойспирали.Основаниявдругихконфигурацияхобозначеныотдельными«полуперекладинами».
соответствие, подаваемый рибонуклеотид ковалентно связывается с наращиваемой цепью РНК в ходе ферментативно катализируемой реакции. Поэтому цепь РНК, произведенная транскрипцией — транскрипт, — удлиняется на один нуклеотид за раз и имеет последовательность нуклеотидов, в точности комплементарную цепи ДНК, используемой в качестве матрицы (рис. 6.7).
Однако транскрипция отличается от репликации ДНК несколькими важными моментами. В отличие от недавно образованной нити ДНК, цепь РНК не остается связанной водородными связями с ДНК-матрицей. Вместо этого, сразу же позади области, в которой присоединяются рибонуклеотиды, цепь РНК вытесняется и спираль ДНК воссоздается. Таким образом, молекулы РНК, произведенные транскрипцией, сходят с матрицы ДНК в виде одинарных цепей. Кроме того, поскольку они копируются только с ограниченной области ДНК, молекулы РНК намного короче молекул ДНК. Молекула ДНК в хромосоме человека может достигать длины 250 миллионов пар нуклеотидов; напротив, большинство молекул РНК включает не более нескольких тысяч нуклеотидов, а многие значительно короче.
Ферменты, которые выполняют транскрипцию, называют РНК-полимеразами (RNA polymerases). Подобно ДНК-полимеразе, которая катализирует репликацию ДНК (мы обсудили это в главе 5), РНК-полимеразы катализируют образование фосфодиэфирных связей, посредством которых нуклеотиды соединяются друг с другом и образуют линейную цепь. РНК-полимераза движется по ДНК скачкообразно,
512 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.6.7.ВрезультатетранскрипцииДНКобразуетсяодноцепочечная молекула РНК, комплементарная одной изцепейДНК.
раскручивая спираль ДНК непосредственно
перед активным участком полимеризации, с
тем чтобы выставить наружу новую область
матричной цепи для комплементарного спаривания оснований. Таким вот путем наращиваемая цепь РНК продолжается, нуклеотид за нуклеотидом, в направлении 5′ → 3′ (рис. 6.8).
Субстратами служат нуклеозидтрифосфаты (ATP, CTP, UTP и GTP); как и при репликации ДНК, гидролиз высокоэнергетических связей обеспечивает энергию, необходимую для осуществления реакции в прямом направлении (см. рис. 5.4).
Практически незамедлительное высвобождение цепи РНК с ДНК-матрицы
входе синтеза означает, что может быть сделано множество копий РНК с одного
итого же гена за относительно короткое время, так как синтез следующих молекул РНК начинается прежде, чем первая РНК будет закончена (рис. 6.9). Когда молекулы РНК-полимеразы почти вплотную — буквально по пятам — следуют друг за другом, то каждая из них движется со скоростью около 20 нуклеотидов
всекунду (скорость, достигнутая эукариотами) и за один час с одного гена может быть синтезировано более тысячи транскриптов.
Хотя РНК-полимераза катализирует, по сути, ту же химическую реакцию, что
иДНК-полимераза, есть некоторые важные различия между действиями этих двух ферментов. Во-первых, что наиболее очевидно, РНК-полимераза катализирует реакцию присоединения рибонуклеотидов, а не дезоксирибонуклеотидов. Во-вторых,
вотличие от ДНК-полимераз, реплицирующих ДНК, РНК-полимеразы способны начинать цепь РНК без затравки. Возможно, это отличие связано с тем, что транскрипция совсем не обязательно должна быть столь же точной, сколь репликация ДНК (см. таблицу 5.1, стр. 414). В отличие от ДНК, РНК не является постоянным хранилищем генетической информации в клетках. РНК-полимеразы делают примерно одну ошибку на каждые 104 нуклеотидов, копируемых в РНК-форму (сравните с частотой ошибок процесса прямого копирования ДНК полимеразой — приблизительно одна на 107 нуклеотидов), и последствия появления ошибки в ходе транскрипции РНК намного менее значимы, чем таковые при репликации ДНК.
Хотя РНК-полимеразы далеко не так точны, как ДНК-полимеразы, которые реплицируют ДНК, они, тем не менее, обладают скромным корректирующим механизмом. Если к растущей цепи РНК добавляется неправильный рибонуклеотид, то полимераза может отступить назад и активный центр фермента может выполнить реакцию вырезания (эксцизии), которая напоминает реакцию, обратную полимеризации, — за исключением того, что здесь вместо пирофосфата используется вода
ивысвобождается нуклеозидмонофосфат.
Учитывая, что и ДНК- и РНК-полимеразы осуществляют направляемую матрицей полимеризацию нуклеотидов, можно было бы ожидать, что ферменты этих двух типов имеют некую структурную аналогию. Однако рентгенокристаллографические исследования ферментов обоих типов показывают, что, кроме наличия принципиально важного иона Mg2+ в каталитическом сайте, они практически не имеют ни-
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 513
Рис. 6.8. ДНК транскрибируется ферментом РНК-полимеразой. а) РНК-полимераза (бледно-голубая)
скачкообразнопередвигаетсяпоДНК,раскручиваяспиральДНКвсвоемактивномучастке.Померепродвиженияполимеразадобавляетнуклеотиды(представленныекакмаленькиеформочкиввидебуквы «T») один за другим к цепи РНК на участке полимеризации, используя оголенную нить ДНК в качестве матрицы.Такимобразом,РНК-транскриптпредставляетсобойкомплементарнуюкопиюоднойиздвух цепей ДНК. Короткая область спирали ДНК–РНК (приблизительно девять пар нуклеотидов в длину) поэтому формируется лишь на миг, и «окно» спирали ДНК–РНК потому перемещается по ДНК вместе сполимеразой.Нуклеотидыпоступаютвактивныйцентрввидерибонуклеозидтрифосфатов(ATP,UTP, CTPиGTP),иэнергия,запасеннаявихмежфосфатныхсвязях,служитдвижущейсилойреакцииполимеризации (см. рис. 5.4). б) Структура РНК-полимеразы бактерий, определенная методом рентгеновской кристаллографии. Четыре различные субъединицы, обозначенные разными цветами, и составляют эту РНК-полимеразу. Нить ДНК, используемая в качестве матрицы, — красная, а нематричная нить — желтая.(Изображениеапереработанонаосноверисунка,любезнопредоставленногоRobertLandick; структураб—великодушныйшагSethDarst.)
514 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.6.9.Транскрипциядвухгенов,наблюдаемаявэлектронныймикроскоп.Намикрофотографиивидно множествомолекулРНК-полимеразы,одновременнотранскрибирующихтотилиинойиздвухсмежных генов.МолекулыРНК-полимеразывыглядяткакрядточеквдольмолекулыДНКсприкрепленнымикней новосинтезированными транскриптами (тонкие нити). Молекулы РНК (рибосомные РНК), показанные вэтомпримере,нетранслируютсявбелок,анапрямуюиспользуютсякаккомпонентырибосом—машин, накоторыхпроисходиттрансляция.Частицана5'-конце(свободномконце)каждоготранскриптарРНК, как полагают, представляет собой зачаток рибосомы. По длинам новосинтезированных транскриптов можно сделать вывод, что молекулы РНК-полимеразы ведут транскрипцию слева направо. (Снимок любезнопредоставилUlrichScheer.)
чего общего. Действительно, ферменты, осуществляющие направляемую матрицей полимеризацию нуклеотидов, по-видимому, появились независимо друг от друга во время ранней эволюции клеток. Одна эволюционная линия привела к современным ДНК-полимеразам и обратным транскриптазам, с коими мы познакомились в главе 5, а также к нескольким односубъединичным РНК-полимеразам вирусов. Другая линия дала все современные клеточные РНК-полимеразы (рис. 6.10), о которых мы говорим в этой главе.
6.1.3. Клетки производят РНК нескольких типов
Большинство генов, заложенных в ДНК клетки, определяет аминокислотную последовательность белков; молекулы РНК, которые копируются с этих генов (и которые в конечном счете направляют синтез белков), называют молекулами
информационной, или матричной, РНК (мРНК; messenger RNA). Конечным продуктом меньшинства генов, однако, является сама РНК. Тщательный анализ полной последовательности ДНК генома дрожжей S. cerevisiae позволил открыть более 750 генов (несколько больше, чем 10 % общего числа генов дрожжей), которые производят РНК в качестве своего конечного продукта. Такие молекулы РНК, подобно белкам, служат ферментативными и структурными компонентами в самых разных процессах, протекающих в клетке. В главе 5 мы встретились с одной из таких РНК — матрицей, заключенной в фермент теломеразу. Хотя многие из таких некодирующих РНК все еще хранят свою тайну, мы увидим в этой главе, что молекулы малой ядерной РНК (snРНК; small nuclear RNA) направляют сплайсинг пре-мРНК с целью образования мРНК, что молекулы рибосомной РНК (рРНК) образуют каркас (core) рибосом и что молекулы транспортной РНК (тРНК; transfer RNA) служат адаптерами, которые подбирают аминокислоты и удерживают их в положенном месте на рибосоме для включения в белковую цепь. Наконец, в главе 7 мы увидим, что молекулы микроРНК (miРНК; microRNA) и молекулы
короткой, или малой, интерферирующей РНК (siРНК; small interfering RNA)
служат ключевыми регуляторами экспрессии генов эукариот (таблица 6.1).
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 515
Рис.6.10.ЭволюциясовременныхклеточныхРНК-полимераз.Согласноэтойгипотезе,РНК-полимеразы эволюционировали от древнего белкового домена, называемого дубль-ψ бочонком. Определяющие эволюционные этапы, как думают, включают димеризацию домена, вставку больших полипептидных «петель», приобретение двух критически важных лизинов, необходимых для ориентации матрицы, иприобретениетрехостатковаспарагиновойкислоты,необходимыхдлясвязыванияионамагниявактивном участке. Эта схема изображает эволюцию двух самых больших субъединиц РНК-полимеразы, которые образуют активный сайт фермента. Здесь показаны структуры β- и β'-субъединиц фермента E.coli,носоответствующиесубъединицыферментаэукариотсостоятснимивблизкомродстве.(Пере-
работаноизL. M. Iyer,E. V. KooninandL. Aravind,BMCStruct.Biol.3:1,2003.)
Каждый транскрибируемый участок ДНК называют единицей транскрип- ции (transcrtiption unit). У эукариот единица транскрипции, как правило, несет информацию только с одного гена и поэтому кодирует либо одну молекулу РНК, либо один-единственный белок (или группу родственных белков, если сплайсинг первичного РНК-транскрипта происходит не одним, а несколькими способами — с получением разных молекул мРНК). У бактерий набор смежных генов часто транскрибируется в виде отдельной единицы; производимая молекула мРНК поэтому несет информацию для нескольких различных белков.
В целом, РНК составляет несколько процентов сухой массы клетки. Основная доля РНК в клетках представлена рРНК; мРНК составляет лишь 3–5 % от общего количества РНК в типичной клетке млекопитающих. Совокупность молекул мРНК состоит из десятков тысяч различных видов, и в каждой клетке имеется в среднем только 10–15 молекул каждого вида мРНК.
516 |
Часть 2. Основные генетические механизмы |
|
|
|
|
|
|
|
|
Таблица6.1.ОсновныевидысинтезируемыхвклеткеРНК |
|
|
|
|
|
ВИД РНК |
ФУНКЦИЯ |
|
|
мРНК |
|
матричные, или информационные, РНК; кодируют белки |
|
|
рРНК |
|
рибосомные РНК; формируют структурный каркас рибосомы и катализируют |
|
|
|
синтез белка |
|
|
|
|
|
|
тРНК |
|
транспортные РНК; центральные участники процесса синтеза белка, выступаю- |
|
|
|
щие в качестве адаптеров между мРНК и аминокислотами |
|
|
|
|
|
|
snРНК |
|
малые ядерные РНК; участвуют во множестве ядерных процессов, включая |
|
|
|
сплайсинг пре-мРНК |
|
|
|
|
|
|
snoРНК |
|
малые ядрышковые РНК; используются для процессинга и химической модифи- |
|
|
|
кации рРНК |
|
|
|
|
|
|
scaРНК |
|
малые РНК из телец Кахаля; используются для модификации snoРНК и snРНК |
|
|
miРНК |
|
микроРНК; регулируют экспрессию генов, обычно блокируя трансляцию от- |
|
|
|
дельных мРНК |
|
|
|
|
|
|
siРНК |
|
малые интерферирующие РНК; выключают экспрессию генов, управляя дегра- |
|
|
|
дацией отдельных мРНК и образованием компактных хроматиновых структур |
|
|
|
|
|
|
другие некоди- |
действуют в различных клеточных процессах, включая синтез теломер, инакти- |
|
|
рующие РНК |
вацию Х-хромосомы и транспорт белков в ЭР |
|
6.1.4. Сигналы, закодированные в ДНК, сообщают РНК-полимеразе, где следует начинать и где останавливать транскрипцию
Для точной транскрипции гена РНК-полимераза должна распознать, в каком месте генома начинать и в каком — завершать свою работу. Способы, которыми РНК-по- лимеразы решают эти задачи у бактерий и эукариот, несколько различаются. Поскольку эти процессы у бактерий проще, с них мы и начнем наш познавательный вояж.
Инициация транскрипции — особенно важный шаг в экспрессии генов, потому что это главная точка, в которой клетка осуществляет регуляцию в отношении того, какие белки нужно синтезировать и какими темпами. У бактерий основной фермент (кор-фермент) РНК-полимераза представляет собой многосубъединичный комплекс, который синтезирует РНК, используя матрицу ДНК в качестве направляющей. Вспомогательная субъединица, называемая фактором σ, соединяется с кор-ферментом и помогает ему в чтении заложенных в ДНК сигналов, которые «сообщают» ему, откуда начинать транскрибирование (рис. 6.11). В совокупности фактор σ и кор-фермент известны под названием холофермент РНК-полимеразы (RNA polymerase holoenzyme); этот комплекс прикрепляется к бактериальной ДНК при столкновении с ней, и холофермент имеет обыкновение быстро скользить по длинной молекуле ДНК — пока не отделится снова. Однако, когда холофермент полимеразы входит в область двойной спирали ДНК, называемую промотором (promoter), — специфическую последовательность нуклеотидов, отмечающую отправную точку для синтеза РНК, — полимераза прочно связывается с этой ДНК. Холофермент полимеразы с помощью фактора σ опознает промоторную последовательность ДНК и образует специфические контакты с частями оснований, которые выставлены на внешней стороне спирали (этап 1 на рис. 6.11).
После того как холофермент РНК-полимеразы таким способом прочно свяжется с промотором ДНК, он раскрывает двойную спираль — чтобы выставить короткий участок нуклеотидов на каждой цепи (этап 2 на рис. 6.11). В отличие от реакции ДНК-хеликазы (см. рис. 5.14), такое ограниченное раскрытие спирали не требует
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 517
Рис. 6.11. Цикл транскрипции РНК-полимеразы бактерий. На этапе 1 холофермент РНК-полимеразы
(кор-фермент полимеразы плюс фактор σ) собирается и находит промотор (см. рис. 6.12). Полимераза раскручивает ДНК в той позиции, с которой должна начаться транскрипция (этап 2), и начинает транскрибирование (этап 3). Этот начальный синтез РНК (иногда называемый «абортивная инициация») характеризуется довольно низкой эффективностью. Однако, как только РНК-полимераза синтезирует приблизительно 10 нуклеотидов РНК, она отсоединяется от промотора ДНК и ослабляет, а в конечном счете, разрывает свои контакты с фактором σ. Тогда полимераза переключается в режим элонгации (продолжения)синтезаРНК(этап4),перемещаясьпоДНК(наэтойсхеме—вправо).Вовремярежима элонгации (этап 5) РНК-полимераза работает с высокой производительностью, причем она покидает матрицуДНКивысвобождаетновотранскрибированнуюРНКтолькотогда,когдаейвстречаетсясигнал терминации(этапы6и7).Сигналытерминации,какправило,закодированывДНК,идействиемногих изнихосновываетсянаобразованиивРНКструктур,дестабилизирующихсвязьРНКсполимеразой(этап 7).УбактерийвсемолекулыРНКсинтезируютсяРНК-полимеразойодноготипа,ицикл,изображенный наданномрисунке,поэтомуотноситсякакксинтезумолекулмРНК,такиксинтезуструктурныхикаталитическихРНК.(Переработанонаосноверисунка,любезнопереданногонамRobertLandick.)
энергии гидролиза ATP. Вместо этого, и полимераза, и ДНК подвергаются обратимым структурным изменениям, которые вводят их в состояние, энергетически более благоприятное, чем состояние первоначального связывания. В раскрученной ДНК одна из двух открывшихся цепей становится матрицей для комплементарного спаривания оснований поступающих рибонуклеотидов, два из которых соединяются полимеразой друг с другом — чтобы начать цепь РНК (шаг 3 на рис. 6.11). После того как первые десять или около того нуклеотидов РНК будут синтезированы (относительно неэффективный процесс, в течение которого полимераза синтезирует и отбрасывает короткие олигомеры РНК), кор-фермент разрывает свои взаимо-
