обе цепи двойной спирали ДНК в одной из рекомбинирующих хромосом. После реакции Spo11 с ДНК этот белок, подобно топоизомеразе, остается ковалентно связанным с разорванной ДНК (см. рис. 5.22). Затем специализированная нуклеаза быстро процессирует концы, связанные белком Spo11, снимая его с них и оставляя выступающие одноцепочечные 3′-концы. В этой точке происходит серия одноцепочечных инвазий и миграций точки ветвления, которые обычно дают промежуточный продукт, состоящий из двух близко расположенных структур Холлидея и часто называемый двойным переходом, или двойной структурой, Холлидея (рис. 5.64).
Хотя в мейозе используются некоторые из тех же самых белков, что функционируют при устранении двунитевых разрывов, здесь эти белки направляются несколькими специфическими для мейоза белками, с тем чтобы они выполняли свои задачи несколько иначе, в силу чего они выдают иные промежуточные продукты ДНК (ср. рис. 5.59 и рис. 5.64). Другое важное отличие заключается в том, что в мейозе рекомбинация происходит предпочтительно между материнскими и отцовскими хромосомными гомологами, а не между новореплицированными, идентичными дуплексами ДНК, которые сводятся в пару в ходе устранения двунитевых разрывов.
Существует два разных способа разрешения двойной промежуточной структуры Холлидея, они представлены на рис. 5.64. В концептуально простейшем случае («без кроссинговера») пары пересекающихся цепей разрезаются в обоих структурах Холлидея одинаковым способом, в результате чего обе спирали отделяются друг от друга в неизмененной форме — за исключением области между двумя структурами Холлидея (см. рис. 5.64, слева; в этой области каждая из спиралей содержит короткий гетеродуплексный участок, смежный с гомодуплексным участком, созданным за счет синтеза ДНК). Если, с другой стороны, обе структуры Холлидея разрешаются противоположным образом (один расщепляется в изначальной паре
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 479
Рис.5.64.Гомологичнаярекомбинациявпроцессемейозаможетпривестиккроссинговеру.Послетого как специфический для мейоза белок Spo11 и комплекс Mre11 разорвут дуплекс ДНК и процессируют концы, гомологичная рекомбинация проходит через двойную структуру Холлидея. Многие последовательные операции, в результате которых происходит кроссинговер хромосом в процессе мейоза, напоминают те, которые используются клеткой для устранения двухцепочечных разрывов (рис. 5.59). Однако в мейозе этот процесс тесно сопряжен с другими мейотическими событиями и направляется белками,такимикакSpo11,которыевырабатываютсятольковмейотическихклетках.
480 Часть 2. Основные генетические механизмы
пересекающихся цепей, а второй — на непересекающихся цепях), то исход имеет намного более глубокие последствия. При разрешении такого типа («кроссинговером») части каждой хромосомы, лежащие выше и ниже от этих двух структур Холлидея, меняются местами, в результате чего образуются две рекомбинантные хромосомы — продукты кроссинговера (см. рис. 5.64, справа. Иногда эти хромосомы называют «кроссоверами» или «кроссоверными хромосомами» — от англ. «crossovers». — Прим. ред.)
Относительно немногие из опосредствованных белком Spo11 двунитевых разрывов ведут к кроссинговеру; большинство (90 % у человека, например) разрешается без него. Еще не известно, как этот выбор осуществляется, но вполне очевидно, что он происходит рано — в процессе рекомбинации, еще до образования структур Холлидея. Относительно немногочисленные продукты кроссинговера, которые все же образуются, распределяются по хромосомам таким образом, что их присутствие в одном положении так или иначе ингибирует кроссинговер в соседних областях. Этот любопытный, но плохо изученный регуляторный механизм, названный контролем кроссинговера (crossover control), возможно, гарантирует приблизительно равномерное распределение участков кроссинговера по хромосомам. У многих организмов во время каждого события мейоза возникает примерно два участка кроссинговера на хромосому — по одному на каждом плече. Как будет сказано подробнее в главе 21, эти области играют важную роль на уровне механики — они участвуют в правильном расхождении хромосом в процессе мейоза.
Разрешается ли мейотическое событие рекомбинации кроссинговером или обходится без него, рекомбинационная машина оставляет позади себя гетеро- дуплексную область, в которой цепь от отцовского гомолога комплементарно спарена с основаниями цепи от материнского гомолога (рис. 5.65). В таких гетеродуплексных областях, которые часто простираются на тысячи пар нуклеотидов, допустима небольшая доля некомплементарных пар оснований. В мейозе из-за множества событий, происходящих без кроссинговера, эти гетеродуплексные области образуют в клетках зародышевой линии разбросанные участки, в которых короткие последовательности ДНК из одного гомолога были вставлены в другой гомолог. И во всех случаях они отмечаются участки потенциальной конверсии генов, то есть участки, в которых четыре гаплоидные хромосомы, образованных в ходе мейоза, содержат три копии короткой последовательности ДНК из одного гомолога и только одну копию этой последовательности из другого гомолога (см. рис. 5.63), что мы сейчас поясним.
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 481
5.5.10. Гомологичная рекомбинация часто приводит к конверсии генов
Все воспроизводящиеся половым путем организмы подчиняются фундаментальному закону генетики, согласно которому каждый родитель вносит равный генетический вклад в потомство, наследующее один полный набор ядерных генов от отца и один их полный набор от матери. В основе этого закона лежит очень точное распределение хромосом по зародышевым клеткам (яйцеклеткам и сперматозоидам), которое происходит во время мейоза. Таким образом, когда диплоидная клетка подвергается мейозу, чтобы произвести четыре гаплоидные клетки зародышевой линии (обсудим это в главе 21), точно половина генов, распределенных по этим четырем клеткам, должна быть материнской (гены, которые диплоидная клетка унаследовала от своей матери), а вторая половина — отцовской (гены, которые диплоидная клетка унаследовала от своего отца). В некоторых организмах (грибы, например) возможно воссоздать и проанализировать все четыре гаплоидные гаметы, произведенные из единственной клетки в процессе мейоза. При исследовании таких организмов обнаружены редкие случаи, когда распределение генов нарушает стандартные законы генетики. Временами, например, мейоз дает три копии материнского варианта гена и только одну копию отцовского аллеля (см. рис. 5.63). Альтернативные варианты одного и того же гена называют аллелями, а отклонение от их ожидаемого распределения в процессе мейоза получило название конверсии гена или генной конверсии (gene conversion). Генетические исследования показывают, что только маленькие отрезки ДНК обычно подвергаются конверсии генов и во многих случаях изменяется только часть гена.
Конверсия генов может быть обусловлена несколькими процессами, происходящими в клетке. Во-первых, синтез ДНК, который сопровождает ранние этапы гомологичной рекомбинации, будет давать области двойной структуры Холлидея, в которых на одном гомологе присутствуют три копии последовательности (см. зеленые нити в нижней части рис. 5.64); эти области и будут образовывать участки конверсии генов. Кроме того, если две цепи, из которых состоит гетеродуплексная область, не содержат идентичных последовательностей нуклеотидов, то появятся неправильно спаренные основания. Эти ошибки могут быть исправлены имеющейся у клетки системой исправления ошибок спаривания, описанной ранее (см. рис. 5.20). Однако когда система «коррекции» используется во время рекомбинации, она не делает никакого различия между отцовской и материнской нитями и будет случайным образом выбирать, какую из цепей ей репарировать. Следствием такого ремонта будет один утраченный аллель, зато второй будет представлен двумя экземплярами (рис. 5.66), что приведет к фактическому «преобразованию» (конверсии) одного аллеля в другой. Таким образом, конверсию генов, поначалу расцениваемую как мистическое отклонение от правил генетики, можно считать прямым следствием работы механизмов гомологичной рекомбинации и репарации ДНК.
5.5.11. Система исправления ошибок спаривания предотвращает беспорядочную рекомбинацию между двумя мало соответствующими друг другу последовательностями ДНК
Итак, мы узнали, что гомологичная рекомбинация полагается на спаривание комплементарных (или почти комплементарных) цепей ДНК, которые изначально
482 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 5.66. Конверсия генов,обусловленная исправлениемошибокспаривания.Вэтом процессенаучасткахгомологичнойрекомбинациимеждуматеринскойиотцовскойхромосомами образуется гетеродуплекс ДНК. Если материнская и отцовская последовательностиДНКслегкаразличны,тогетеродуплекснаяобластьбудетвключатьнесколько некомплементарных пар оснований, которые могут впоследствии быть исправлены машинами устранения ошибок спаривания вДНК(см.рис.5.20).Такая«корректировка» может «стереть» нуклеотиды или на отцовской,илинаматеринскойнити.Следствием же устранения ошибок спаривания будет конверсия, обнаруживаемая как отклонение от расхождения равного числа копий материнских и отцовских аллелей, которое обычнопроисходитвмейозе.
принадлежали разным дуплексам ДНК. Но чем определяется точность их соответствия? Это особенно важно для событий рекомбинации, которые разрешаются кроссинговером. Например, геном человека содержит много наборов близкородственных последовательностей ДНК, и если бы кроссинговер мог происходить между всеми ними, то в клетке попросту наступил бы хаос.
Хотя мы до конца не понимаем, как клетки предотвращают нежелательный кроссинговер, мы все же знаем, что компоненты той же системы исправления ошибок спаривания, которая устраняет ошибки репликации (см. рис. 5.20) и задействована в конверсии генов (см. рис. 5.66), выполняют еще одну функцию — прерывать генетическую рекомбинацию между плохо соответствующими друг другу последовательностями ДНК. Считают, что система исправления ошибок обычно распознает ошибочно спаренные основания при первичном обмене цепями, и — если несоответствия значительные — предотвращает последующие этапы (особенно миграцию точки ветвления), ведущие к кроссинговеру. Такой тип рекомбинационной коррекции, как думают, предотвращает события беспорядочной рекомбинации, которые в ином случае превратили бы весь геном человека в неприглядную мешанину (рис. 5.67). Высказывается предположение (хотя оно и спорно), что рекомбинационная коррекция помогает сохранять целостность видов, особенно среди бактерий, блокируя генетический обмен между близкородственными видами. Например, геномы E. coli
иSalmonella typhimurium на 80 % идентичны по нуклеотидным последовательностям,
ивсе же этот коррекционный шаг блокирует рекомбинацию между их геномами.
Заключение
Гомологичная рекомбинация (называемая также общей рекомбинацией) вы- ражается в переносе генетической информации между участками двух двойных спиралей ДНК с подобной последовательностью нуклеотидов. Этот процесс важен для безошибочного исправления повреждения хромосом во всех клетках, а также при кроссинговере хромосом, происходящем во время мейоза. Собы- тие рекомбинации направляется специализированным набором белков. Хотя
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 483
Рис. 5.67. Механизм, который при общей рекомбинации предотвращает дестабилизацию генома, содержащего повторяющиеся последовательности. Компоненты системы исправления ошибок спа-
рекомбинация может произойти в любом месте молекулы ДНК, необходимым условием начала рекомбинационных событий является наличие комплементар- ных взаимодействий, происходящих на обширных участках между цепями двух
двойных спиралей ДНК, вовлекаемых в рекомбинацию.
В процессе мейоза гомологичная рекомбинация начинается с двухцепочечных разрывов, которые «преднамеренно допускаются» на каждой хромосоме. Эти разрывы процессируются в одноцепочечные 3′-концы, которые в ходе реакции, катализируемой белками семейства RecA, вторгаются в гомологичный партнер- ский дуплекс ДНК. Далее миграция точки ветвления, сопровождаемая ограни- ченным синтезом ДНК, ведет к формированию четырехцепочечных структур, известных как двойные структуры Холлидея. Каждая реакция рекомбинации заканчивается, когда эти промежуточные продукты «разрешаются» перереза- нием ДНК. Результатом могут быть или две хромосомы, образовавшиеся в ходе кроссинговера (то есть хромосомы, в которых ДНК по обе стороны от участка
спаривания происходит из двух разных гомологов), или две хромосомы, не пре- терпевшие кроссинговер. В последнем случае две образовавшиеся хромосомы идентичны двум исходным гомологам — за исключением незначительного из- менения последовательности ДНК на самом участке рекомбинации. В отличие от ситуации в мейозе, реакции гомологичной рекомбинации, которые безупречно устраняют двухцепочечные разрывы, редко заканчиваются кроссинговером.
484 Часть 2. Основные генетические механизмы
5.6. Транспозиция и консервативная сайт-специфическая рекомбинация
Мы познакомились с тем, как посредством гомологичной рекомбинации между участками ДНК происходят перестройки, которые могут закончиться обменом последовательностей ДНК между хромосомами. Однако порядок генов на взаимодействующей хромосоме, как правило, остается неизменным в ходе гомологичной рекомбинации, поскольку условием протекания этого процесса является высокая степень подобия участвующих в этом процессе последовательностей. В данном параграфе мы описываем рекомбинацию двух совершенно иных типов: транспозицию
(называемую также транспозиционной рекомбинацией) и консервативную сайт-
специфическую рекомбинацию (conservative site-specific recombination), которым не требуется протяженных областей гомологии ДНК. События рекомбинации этих двух типов могут видоизменить порядок генов на хромосоме и обусловить необычные типы мутаций, которые привносят новую информацию в геномы.
Транспозиция и консервативная сайт-специфическая рекомбинация главным образом нацелены на перемещение широкого разнообразия специализированных сегментов ДНК, собирательно нареченных подвижными, или мобильными, генети- ческими элементами (mobile genetic elements), из одной позиции генома в другую. Мы увидим, что подвижные генетические элементы могут варьировать по размеру: от нескольких сотен до десятков тысяч пар нуклеотидов — и каждый из них обычно несет уникальный набор генов. Нередко один из таких генов кодирует специализированный фермент, который катализирует перемещение только этого элемента и таким образом делает рекомбинацию этого типа возможной.
Практически все клетки содержат мобильные генетические элементы (именуемые на сленге jumping gene, то есть «прыгающие гены»). Как объясняется в главе 4, в эволюционных масштабах они оказали глубокое воздействие на оформление современных геномов. Например, почти половина генома человека ведет свое начало от таких элементов (см. рис. 4.17). С течением времени случайные мутации видоизменили их нуклеотидные последовательности, и в результате лишь немногие из многочисленных копий этих элементов в нашей ДНК все еще активны и способны совершать «прыжки». Остальные суть не что иное, как «молекулярные ископаемые», существование которых открывает перед нами поразительную картину истории нашей собственной эволюции.
Мобильные генетические элементы часто рассматривают как молекулярных паразитов (их называют также «эгоистичной ДНК»), которые продолжают существовать, потому что клетки не могут избавиться от них; они, несомненно, близки
ктому, чтобы превысить по объему наш собственный геном. Однако подвижные элементы ДНК могут давать клетке и определенные преимущества. Например, гены, которые они несут, иногда полезны, как, скажем, в случае устойчивости
кантибиотикам в клетках бактерий, о чем мы побеседуем чуть позже. Перемещение подвижных генетических элементов создает также многие из генетических вариантов, от которых зависит эволюция, потому что вдобавок к собственному «передвижничеству» мобильные генетические элементы эпизодически перестраивают соседствующие с ними последовательности генома хозяина. Так, спонтанные мутации, наблюдаемые у дрозофилы, человека и прочих организмов, нередко происходят из-за переместившихся генетических элементов. Тогда как подавляющее большинство таких мутаций будет губительно для организма, некоторые приведут
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 485
к повышенной приспособляемости и определенно будут распространяться по всей популяции. Почти наверняка многое из того разнообразия жизни, которое нас окружает, берет начало от перемещения подвижных генетических элементов.
В этом разделе мы представляем на суд читателей подвижные генетические элементы и описываем механизмы, которые позволяют им передвигаться по геному. Мы увидим, что некоторые из таких элементов перемещаются, используя механизмы транспозиции, а иные — путем консервативной сайт-специфической рекомбинации. Мы начнем с транспозиции, так как известно намного больше примеров передвижения такого рода.
5.6.1. Посредством транспозиции мобильные генетические элементы могут быть встроены в любую последовательность ДНК
Подвижные элементы, которые перемещаются посредством транспозиции, назы-
вают транспозонами (transposons) или транспонируемыми элементами (transposable elements). При транспозиции специальный фермент, обычно кодируемый самим транспозоном и именуемый транспозазой, действует на специфичную последовательность ДНК на обоих концах транспозона, побуждая его к встраиванию в новый целевой участок ДНК. В большинстве своем транспозоны лишь умеренно избирательны в выборе целевого участка и могут поэтому самовстраиваться во многие разные позиции генома. В частности, нет никакого общего требования наличия гомологии между концами мобильного элемента и целевой последовательностью. Большинство транспозонов перемещается лишь изредка. У бактерий, где возможно точно измерить частоту, транспозоны обычно передвигаются один раз на 105 клеточных генераций. В большинстве случаев транспозиция представляет собой редкий стохастический процесс, за исключением одного момента, часто связанного с прохождением репликационной вилки.
На основе своей структуры и механизма транспозиции транспозоны могут быть разбиты на три больших класса: ДНК-транспозоны(DNA-only transposons),
ретровирус-подобные ретротранспозоны (retroviral-like retrotransposons) и не-
ретровирусные ретротранспозоны (nonretroviral retrotransposons). Каждый класс будет рассмотрен подробно ниже. Общие сведения о различиях между ними при желании можно найти в таблице 5.3.
5.6.2. ДНК-транспозоны для перемещения используют как механизм вырезания-вставки, так и механизм репликации
ДНК-транспозоны преобладают в геномах бактерий и отвечают главным образом за развитие устойчивости к антибиотикам в штаммах бактерий. Когда антибиотики, например пенициллин и стрептомицин, стали общедоступными в 1950 е гг., большинство болезнетворных для человека бактерий было восприимчиво к ним. Пятьдесят лет спустя ситуация совершенно изменилась — антибиотики наподобие пенициллина (и его современных производных) более не действуют на многие современные штаммы бактерий, в том числе и вызывающие гонорею и бактериальную пневмонию. За развитие устойчивости к антибиотикам главным образом ответственны гены, которые кодируют инактивирующие антибиотик ферменты, — а их несут транспозоны (рис. 5.68). Хотя эти подвижные элементы могут перемещаться только в пределах клеток, которые и так уже их содержат, они могут быть перенесены из одной клетки в другую посредством иных механизмов, известных под общим
Примечание. Длина этих элементов колеблется от 1 000 до примерно 12 000 п. н. В состав каждого семейства входит много различных элементов, в таблице приведены лишь немногие из них. Кроме мобильных элементов, некоторые вирусы тоже могут встраиваться в хромосому клетки-хозяина и исключаться с использованием механизмов транспозиции. Такие вирусы относятся к первым двум классам транспозонов.
названием горизонтального переноса генов (рис. 1.23). Попав в новую клетку, транспозон может встроиться в ее геном и неизменно передаваться всем клеткампотомкам посредством обычных процессов репликации ДНК и деления клеток.
ДНК-транспозоны,названные так, потому что во время своего передвижения они существуют только в форме ДНК, способны перебазироваться из донорного участка в целевой участок или путем транспозиции «вырезания и вставки» (cut- and-paste transposition), или посредством репликативной транспозиции (replicative transposition). По причине концептуальной простоты первой, сначала мы обсудим именно ее механизм. Процесс начинается, когда каждая из специальных коротких последовательностей ДНК, которые «помечают» оба конца мобильного элемента, связывает молекулу транспозазы. Эти две молекулы транспозазы сходятся друг с другом и образуют мультимерную «транспозосому», которая образует петлю ДНК, совмещая оба конца подвижного элемента (рис. 5.69). После этого транспозаза производит разрезы в основании петли и удаляет элемент полностью из его хромосомы, образуя центральный промежуточный продукт процесса транспозиции (рис. 5.70). Чтобы завершить перемещение ДНК, транспозаза катализирует прямое внедрение обоих концов ДНК подвижного элемента в целевую молекулу ДНК, разрывая две
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 487
Рис.5.68.ТриизмножестваДНК-транспозонов,обнаруженныхубактерий.Каждыйизэтихмобильных элементов ДНК содержит ген, кодирующий транспозазу — фермент, который осуществляет, по крайней мере, часть реакций разрыва и соединения ДНК, необходимых для перемещения этого элемента. КаждыйтранспозоннесеттакжекороткиепоследовательностиДНК(обозначенныекрасным),которые распознаютсятолькотранспозазой,кодируемойэтимэлементом,инеобходимыдляпередвиженияэтого элемента. Кроме того, два из трех показанных на рисунке подвижных элементов несут гены, которые кодируют ферменты, инактивирующие антибиотики ампициллин (AmpR) и тетрациклин (TetR). Транспонируемый элемент Tn10, показанный на нижней схеме, как думают, эволюционировал в результате случайной «посадки» двух намного более коротких подвижных элементов по обе стороны гена устойчивости к тетрациклину: повсеместное применение тетрациклина как антибиотика привело к отбору бактерий,распространяющихэтоттранспозонвпопуляцияхбактерий.
фосфодиэфирные связи в последней и создавая две новые в момент объединения подвижного элемента с целевой ДНК. Поскольку эта реакция соединения ДНК начинается и заканчивается одним и тем же числом фосфодиэфирных связей, она может происходить без «поставки» дополнительной энергии. В следующей главе мы увидим, что того же самого типа перестройка фосфодиэфирных связей (названная переэтерификацией) лежит в основе другого фундаментального процесса молекулярной биологии — сплайсинга РНК.
Поскольку разрывы, производимые в двух цепях ДНК-мишени, ступенчатые (красные стрелки на рис. 5.69), ДНК-продукт первоначально содержит два коротких однонитевых отрезка, по одному на каждом из концов вставленного транспозона. ДНК-полимераза и ДНК-лигаза клетки-хозяина заполняют и запечатывают эти бреши, на чем и завершается процесс рекомбинации. В результате этого происходит короткая дупликация целевой последовательности ДНК на участке вставки; такие примыкающие, или фланкирующие, с обеих сторон последовательности прямых повторов, длина которых различна у разных транспозонов, служат удобными «метками» свершившихся событий транспозиции.
Когда прибегающий к механизму вырезания и вставки ДНК-транспозон удаляется из своего первоначального местоположения, на его месте в хромосоме остается «дыра». Такая рана может быть полностью залечена рекомбинационной репарацией двухцепочечных разрывов (см. рис. 5.59), при условии, что хромосома реплицирована совсем недавно и в наличии имеется точная копия этой еще неповрежденной хозяйской последовательности. В таком случае процесс устранения разрывов восстановит транспозон в его первоначальной позиции. Как альтернатива — в диплоидных организмах поврежденная хромосома может быть отремонтирована рекомбинационным способом с использованием хромосомного гомолога; в этом
