Volume1

518 Часть 2. Основные генетические механизмы

действия с промоторной ДНК, ослабляет свои взаимодействия с фактором σ и начинает перемещаться вперед по ДНК, синтезируя РНК (этапы 4 и 5 на рис. 6.11). Так элонгация (удлинение) цепи продолжается (со скоростью приблизительно 50 нуклеотидов в секунду для бактериальных РНК-полимераз) до тех пор, пока фермент не сталкивается со вторым сигналом на ДНК, стоп-сигналом, который называют терминатором (terminator; будет описан ниже), на котором полимераза останавливается и высвобождает как новообразованную цепь РНК, так и матрицу ДНК (этап 7 на рис. 6.11). После того как кор-фермент полимеразы освобождается на терминаторе, он повторно связывается со свободным фактором σ и образует холофермент, который снова может начать процесс транскрипции.

Процесс инициации транскрипции сложен и требует, чтобы холофермент РНК-полимераза и ДНК претерпели ряд конформационных изменений. Мы можем рассматривать эти изменения как раскрытие ДНК и размещение ее в активном участке, что сопровождается «утяжкой» (сжиманием) фермента вокруг ДНК и РНК, чтобы гарантировать, что он не отделится от них прежде, чем закончит транскрибировать ген. Если РНК-полимераза отделится преждевременно, то она не сможет возобновить синтез, но должна будет начать его снова на промоторе.

Как терминаторы ДНК останавливают элонгацию? Для большинства генов бактерий стоп-сигнал состоит из строки пар нуклеотидов A–T c предшествующей ей последовательностью ДНК, обладающей двойной симметрией, которая, будучи транскрибирована в РНК, сворачивается в структуру «шпильки» путем уотсон-криковского (комплементарного) спаривания оснований (см. рис. 6.11). Когда полимераза транскрибирует терминатор, то образование шпильки может способствовать «вытягиванию» РНКтранскрипта из активного участка. Гибрид ДНК–РНК в активном сайте, удерживаемый в терминаторе преимущественно за счет взаимодействия между парами оснований U–A (такие пары менее стабильные, чем пары оснований G–C, потому что в них две, а не три водородные связи на пару оснований), недостаточно прочен, чтобы удержать РНК, и поэтому диссоциирует, вызывая высвобождение ДНК из полимеразы (этап 7 на рис. 6.11). Таким образом, в некотором отношении при терминации транскрипции структурные переходы, которые произошли во время инициации, обращаются вспять. Кроме того, процесс терминации служит примером лейтмотива этой главы: укладка РНК в определенные структуры влияет на многие этапы расшифровки генома.

6.1.5.  И сигналы начала транскрипции, и сигналы ее окончания гетерогенны по нуклеотидным последовательностям

Как мы только что убедились, процессы инициации и терминации транскрипции включают в себя ряд сложных структурных переходов в молекулах белка, ДНК и РНК. Зачастую распознавание закодированных в ДНК сигналов, которые задают эти переходы, представляет для исследователей трудную задачу. Действительно, сравнение множества различных бактериальных промоторов показывает удивительную степень разнообразия. Тем не менее все они содержат родственные последовательности, отражающие отчасти те черты ДНК, которые напрямую распознаются фактором σ. Такие общие особенности часто сводятся в форму консен-

сусной последовательности (consensus nucleotide sequence; рис. 6.12). Консен-

сусную последовательность нуклеотидов получают путем сравнения множества последовательностей с одинаковой основной функцией и последующего расчета наиболее часто встречающихся нуклеотидов в каждой позиции. Поэтому она служит

Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 523

В широком смысле, общие факторы транскрипции эукариот выполняют функции, эквивалентные таковым σфактора у бактерий; и в самом деле, части TFIIF имеют ту же трехмерную структуру, что и соответсвующие части σ.

На рис. 6.16 показано, как общие факторы транскрипции собираются на промоторах, используемых РНК-полимеразой II, а в таблице 6.3 подытожены их функции. Процесс сборки начинается, когда общий фактор транскрипции TFIID связывается с короткой двухцепочечной последовательностью ДНК, преимущественно состоящей

Рис. 6.16. Инициация транскрипции гена эукариот РНК-полимеразой II. Чтобы начать транскрипцию,

РНК-полимеразетребуетсянесколькообщихфакторовтранскрипции.а)Промоторсодержитпоследова- тельностьДНК,называемуюTATA-бокс, которая расположена на расстоянии

25 нуклеотидов от сайта инициации транскрипция. б) Через свою субъединицу TBP TFIID распознает и свя-

зывает ТАТА-бокс, что впоследствии

обеспечивает смежное связывание TFIIB.в)ДляпростотыискажениеДНК, производимоесвязываниемTFIID(см. рис. 6.18), не показано. г) Остальные

общиефакторытранскрипции,атакже

и сама РНК-полимераза, собираются на промоторе. д) После этого TFIIH использует ATP, чтобы расклинить двой-

нуюспиральДНКвточкеначалатранс-

крипции, локально выставляя наружу матричную нить. Наряду с этим, TFIIH фосфорилируетРНК-полимеразуII,из-

меняяееконформациютак,чтополи-

меразаосвобождаетсяотобщихфакто-

ровиможетначатьстадиюэлонгации

транскрипции.Какпоказанонасхеме,

участок фосфорилирования представляет собой длинный С-концевой полипептидныйхвост,называемыйтакже C-концевым доменом (CTD), который

какбывыставленизмолекулыполимеразы.Представленнаянарисункесхема сборки составлена по результатам

экспериментов, проводимых in vitro,

и точный порядок, в котором общие

факторытранскрипциисобираютсяна

промоторах,можетизменятьсяотгена к гену in vivo. Общие факторы транскрипции в ходе эволюции сохранили высокуюконсервативность;некоторые

изних,свойственныеклеткамчеловека,могутбытьзамененывбиохимических экспериментах соответствующими факторами, присущими простым

дрожжам.

524 Часть 2. Основные генетические механизмы

Таблица 6.3. Общие факторы транскрипции, необходимые для инициации транскрипции РНК-по- лимеразойIIэукариот

Примечание: TFIID состоит из TBP и примерно 11-ти дополнительных субъединиц, называемых

TAFs (TBP-associated factors; связанные с TBP факторы).

из нуклеотидов T и А. По этой причине такая последовательность известна под названием последовательность TATA, или TATA-бокс, а субъединица TFIID, которая узнает ее, была названа TBP (TATA-box binding protein; связывающий ТАТА-бокс белок). TATA-бокс обычно расположен на 25 нуклеотидов выше участка начала транскрипции. О начале транскрипции сигнализирует отнюдь не только последовательность ДНК (рис. 6.17), но для большинства промоторов полимеразы II именно этот сигнал самый значимый. Связывание TFIID вызывает сильное искажение последовательности ДНК в районе TATA-бокса (рис. 6.18). Это искажение, как думают, служит физическим ориентиром для определения местоположения активного промотора в безбрежном пространстве генома, при этом последовательности ДНК с обеих сторон искажения сводятся вместе, чтобы подготовить тем самым площадку для последующих этапов сборки белков. Затем собираются другие факторы и РНК-полимераза II, и образуется полноценный комплекс инициации транскрипции (transcription initiation complex;

см. рис. 6.16). Наиболее сложно организованным общим фактором транскрипции является TFIIH. Состоящий из 9 субъединиц, он почти такого же размера, как сама РНК-полимераза II, и, как мы увидим вскоре, выполняет несколько ферментативных функций, необходимых для инициации транскрипции.

После образования инициаторного комплекса транскрипции на промоторной ДНК РНК-полимераза II должна получить доступ к матричной цепи в точке начала транскрипции. Фактор TFIIH, который содержит ДНК-хеликазу как одну из своих субъединиц, делает этот шаг возможным, гидролизуя ATP и раскручивая ДНК, и тем самым открывая матричную нить. Затем РНК-полимераза II, подобно бактериальной полимеразе, остается на промоторе и синтезирует короткие отрезки РНК, пока не претерпит ряд конформационных изменений, которые позволят ей отойти от промотора и вступить в фазу элонгации транскрипции. Ключевой шаг в этом переходе — присоединение фосфатных групп к «хвосту» РНК-полимеразы (известному как CTD, или С-концевой домен). У человека CTD состоит из 52 тандемных 7-аминокислотных повторов и выступает из основной структуры РНК-полимеразы. Во время инициации

526 Часть 2. Основные генетические механизмы

транскрипции серин, расположенный в пятой позиции повтора (Ser5), фосфорилируется фактором TFIIH, который содержит протеинкиназу в другой из своих субъединиц (см. рис. 6.16, г и д). Полимераза может теперь отделиться от группы общих факторов транскрипции. В ходе этого процесса она претерпевает ряд конформационных изменений, которые усиливают ее взаимодействие с ДНК, и приобретает новые белки, которые позволяют ей транскрибировать длинные последовательности, причем в некоторых случаях в течение многих часов, — не отделяясь от ДНК.

Как только полимераза II начала элонгацию РНК-транскрипта, большинство общих факторов транскрипции отделяется от ДНК, так что они опять готовы к запуску следующего цикла транскрипции с новой молекулой РНК-полимеразы. Как мы увидим вскоре, фосфорилирование хвоста РНК-полимеразы II обеспечивает также и «загрузку» ее машинерией процессинга РНК, что позволяет процессирующим РНК белкам модифицировать новотранскрибированную РНК по мере ее выхода из полимеразы.

6.1.8.  Полимеразе II требуются также активатор, медиатор и модифицирующие хроматин белки

Исследования поведения РНК-полимеразы II и принятых в ее «свиту» общих факторов транскрипции, проведенные в экспериментах in vitro на очищенных матрицах ДНК, позволили построить только что описанную модель инициации транскрипции. Однако, как обсуждалось в главе 4, в клетках эукариот ДНК упакована

внуклеосомы, которые, сверх этого, организованы в хроматиновые структуры более высокого порядка. В результате запуск транскрипции в клетке эукариот более сложен и требует еще большего числа белков, чем при использовании очищенной ДНК. Во-первых, регулирующие экспрессию генов белки, известные как активаторы транскрипции (transcriptional activators), должны связаться с определенными последовательностями ДНК и помочь рекрутировать РНК-полимеразу II к точке начала транскрипции (рис. 6.19). Роль активаторов мы обсудим в главе 7, потому что они составляют один из главных инструментов, используемых клеткой для регуляции экспрессии генов. Здесь же мы просто отмечаем, что для инициации транскрипции

вэукариотической клетке необходимо их наличие на ДНК. Во-вторых, у эукариот для запуска транскрипции in vivo требуется присутствие белкового комплекса, известного как медиатор, который позволяет активаторным белкам взаимодействовать должным образом с полимеразой II и с общими факторами транскрипции. В-третьих,

вэукариотической клетке для инициации транскрипции обычно необходимы локально рекрутированные модифицирующие хроматин ферменты, в том числе комплексы перестройки хроматина и гистон-модифицирующие ферменты. Как обсуждалось

вглаве 4, ферменты обоих типов делают ДНК, находящуюся в хроматине, более доступной и тем самым облегчают сборку на ДНК машины инициации транскрипции. В главе 7 мы еще вернемся к роли этих ферментов в инициации транскрипции.

Как показано на рис. 6.19, большое число белков (намного более 100 отдельных субъединиц) должно собраться в точке начала транскрипции, чтобы запустить ее в клетке эукариот. Порядок сборки этих белков, кажется, не следует по предписанному пути; скорее, он отличается от гена к гену. И в самом деле, некоторые из этих разных белковых комплексов могут взаимодействовать друг с другом вдали от ДНК и устанавливаться на ДНК в виде предварительно собранных субансамблей. Чтобы начать транскрибирование, РНК-полимераза II должна высвободиться из этого большого комплекса белков; в дополнение к тем этапам, которые описаны на рис. 6.16, еще часто требуется протеолиз белка-активатора in situ. Мы вернемся