Volume1
.pdf
458 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.5.48.СравнениедвухосновныхспособоврепарацииДНК.а) Эксцизионнаярепарацияоснований.
Этот путь начинается с ДНК-гликозилазы. Здесь фермент урацил-ДНК-гликозилаза удаляет спонтанно дезаминированный цитозин из ДНК. После действия этой гликозилазы (или иной ДНК-гликозилазы, которая распознает иной вид повреждения) сахарофосфат с отсутствующим основанием вырезается последовательнымдействиемAР-эндонуклеазыифосфодиэстеразы.(Тежесамыеферментыначинают тутжевосстановлениедепуринизированныхучастков.)Затембрешьединственногонуклеотидазаделывается ДНК-полимеразой и ДНК-лигазой. В конечном итоге на место U, который появился в результате спонтанногодезаминирования,обратностановитсяC.AP-эндонуклеазатакназванапотому,чтоонаузнает любой участок в спирали ДНК, который содержит сахар дезоксирибозу с отсутствующим основанием; такие участки могут возникнуть либо в силу потери пурина (апуриновые участки), либо вследствие потери пиримидина (апиримидиновые участки). б) Эксцизионная репарация нуклеотидов. У бактерий, после того как мультиферментный комплекс распознает повреждение типа пиримидинового димера (см. рис. 5.46), с двух сторон от повреждения производится разрез, и ассоциированная с комплексом ДНК-хеликаза удаляет вырезанную часть поврежденной нити. «Машина эксцизионной репарации» у бактерий оставляет после себя брешь из 12 нуклеотидов, что показано на рисунке. У человека, как только поврежденная ДНК опознана, хеликаза рекрутируется для локального раскручивания двойной спиралиДНК.Затемэксцизионнаянуклеазавходитвзонудействияирасщепляетсвязипообестороны повреждения, оставляя после себя брешь приблизительно из 30 нуклеотидов. Машины эксцизионной репарациинуклеотидовиубактерий,иучеловекамогутраспознаватьирепарироватьмножествораз- личныхвидовДНК-повреждений.
просто эксцизией. Этот механизм может устранять повреждения, обусловленные почти любым существенным изменением в структуре двойной спирали ДНК. К таким «массивным повреждениям» относятся ковалентные связи, образовавшиеся
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 459
Рис.5.49.УзнаваниенеобычногонуклеотидавДНКвходе«выпячиванияоснований»(base-flipping).
ФерментыизсемействаДНК-гликозилазспецифическиузнаютоснованиявпоказаннойконформации. Каждыйизэтихферментоврасщепляетгликозиднуюсвязь,котораясоединяетспецифическиузнаваемое основание(желтое)ссахаромосновнойцепи,иудаляетэтооснованиеизДНК.а)Стержневаямодель; б)объемнаямодель.
воснованиях ДНК в результате их взаимодействия с крупными углеводородами (например, канцерогенным соединением бензопиреном), а также друг с другом: пиримидиновые основания под действием солнечного света могут образовывать димеры T–T, T–C и C–C. При этом способе репарации крупный мультиферментный комплекс просматривает ДНК на предмет всякого искажения в двойной спирали, а не какого-либо специфического видоизменения основания. Как только объемное повреждение найдено, он расщепляет фосфодиэфирную связь в сахарофосфатном остове «неправильной» нити по обе стороны от искажения, и ДНК-хеликаза удаляет однонитевой олигонуклеотид, содержащий обнаруженное повреждение. Затем эта большая брешь, образовавшаяся в спирали ДНК, заделывается ДНК-полимеразой и ДНК-лигазой (рис. 5.48, б).
Альтернативой процессам репарации путем вырезания оснований и нуклеотидов выступает прямое химическое исправление повреждения ДНК, и эта стратегия используется для быстрого удаления некоторых особо мутагенных или цитотоксических повреждений. Например, поврежденный продукт алкилирования О6-метилгуанин исправляется путем удаления его метильной группы прямым переносом ее на остаток цистеина в самом репарирующем белке, который разрушается
входе реакции. В другом примере метильные группы в продуктах алкилирования: 1-метиладенине и 3-метилцитозине — «выжигаются» железозависимой деметилазой с высвобождением формальдегида из метилированной ДНК и восстановлением нативного основания.
460 Часть 2. Основные генетические механизмы
5.4.4. Сопряжение процесса репарации ДНК с транскрипцией гарантирует исправность наиболее значимой для клетки части ДНК
Вся содержащаяся в клетке ДНК находится под постоянным контролем на предмет наличия повреждений, и механизмы репарации, которые мы описали, несут свое «дежурство» во всех частях генома. Однако клетки имеют способ направлять процессы репарации ДНК к тем последовательностям, которые особенно срочно востребованы. Они делают это, связывая РНК-полимеразу — фермент, который транскрибирует ДНК в РНК на первом этапе экспрессии генов, —с исправлением поврежденной ДНК. РНК-полимераза застопоривается в местах повреждения ДНК и с помощью сопряженных с ней белков направляет машины репарации к таким участкам. У бактерий, гены которых относительно коротки, застопоренная РНК-полимераза отделяется от ДНК, ДНК репарируется и ген транскрибируется снова — с самого начала. У эукариот, гены которых могут быть чрезвычайно длинными, используется более сложная реакция, призванная «придержать» РНК-полимеразу, отремонтировать повреждение и затем повторно запустить полимеразу.
Сопряженная с транскрипцией репарация работает по механизмам эксцизии оснований и нуклеотидов и прочими репарирующими машинами, чтобы, случись повреждение, незамедлительно направить все необходимое к самым важным последовательностям ДНК клетки, а именно к тем, которые экспрессируются в данный момент. Что примечательно, репарация данного типа — процесс, специфичный к матричной цепи транскрибируемой ДНК; другая цепь исправляется с той же скоростью и эффективностью, что и ДНК, которая вообще не транскрибируется. Сопряженная с транскрипцией репарация особенно важна для человека, потому что в каждый момент времени транскрибируется лишь малая доля нашего генома. Важность этого механизма можно проследить на индивидах с синдромом Кокейна — заболевания, которое вызвано дефектом сопряженной с транскрипцией репарации. Эти больные страдают замедлением роста, отклонениями в строении скелета, прогрессирующей атрофией нервной системы и повышенной чувствительностью к солнечному свету. Большинство этих проблем, как думают, является результатом остановки (застопоривания) молекул РНК-полимеразы — раз и навсегда — на участках повреждений ДНК, которые расположены в областях жизненно важных генов.
5.4.5. Как особенности структуры, так и химические свойства оснований ДНК облегчают выявление повреждений
Двойная спираль ДНК, кажется, оптимально устроена для репарации. Как было отмечено выше, она содержит резервную копию всей генетической информации. Что не менее важно, самое естество четырех входящих в состав ДНК оснований обусловливает очень четкие различия между неповрежденными и поврежденными основаниями. Например, каждое возможное событие дезаминирования в ДНК дает «неестественное» основание, которое может быть непосредственно опознано и удалено специфической ДНК-гликозилазой. Гипоксантин, например, является простейшим пуриновым основанием, способным к специфическому спариванию с C, но гипоксантин есть прямой продукт дезаминирования А (рис. 5.50, а). Добавление второй аминогруппы к гипоксантину дает G, который не может образоваться из А путем самопроизвольного дезаминирования и продукт дезаминирования которого (ксантин) аналогичным образом уникален.
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 461
Рис. 5.50. Дезаминирование нуклеотидовДНК. В каждом случае атом кислорода, который присоединяется к основанию в ходе реакции с участием воды, окрашен красным. а) Продукты спонтанного дезаминирования нуклеотидов А и G в ДНК распознаются как неправильные и, таким образом, легко узнаются и исправляются. Дезаминирование C в U было представлено также на рис. 5.45; T не имеет аминогруппы, которая могла бы быть удалена. б) Около 3 % нуклеотидов C в ДНК позвоночных метилировано, что необходимо для выполнения задачи регуляции экспрессии генов (обсудим в главе 7). Когда такой нуклеотид, 5-метил-C, случайно дезаминируется, образуется естественный нуклеотид T. Однако этот T будет спарен с G на противоположной нити, а это не будет соответствовать правильной, комплементарной,пареоснований.
462 Часть 2. Основные генетические механизмы
Как будет рассказано в главе 6, РНК, как думают, в эволюционном масштабе времени служила генетическим материалом еще до ДНК, и кажется весьма вероятным, что генетический код изначально закладывался в четырех нуклеотидах: A, C, G и U. На этой почве возникает вопрос: почему U в РНК заменен в ДНК на T (который есть не что иное, как 5-метил-U). Как мы могли убедиться, спонтанное дезаминирование C преобразует его в U, но это событие в достаточной мере обезвреживается урацил-ДНК-гликозилазой. Однако, если бы ДНК содержала U
вкачестве естественного основания, то системе репарации было бы сложно отличать дезаминированный C от нативного U.
Особая ситуация возникает в ДНК позвоночных, где некоторые нуклеотиды C метилированы в специфических последовательностях C–G, ассоциированных с неактивными генами (обсуждаем в главе 7). Спонтанное дезаминирование таких метилированных нуклеотидов C дает естественный нуклеотид T (рис. 5.50, б), который, как получается, образует «неправильную» пару с G в противоположной нити ДНК. Чтобы помочь репарировать дезаминированные метилированные нуклеотиды C, специальная ДНК-гликозилаза распознает неправильную пару оснований T–G и удаляет T. Однако этот механизм репарации ДНК, должно быть, малоэффективен, потому что метилированные нуклеотиды C служат распространенной мишенью для мутаций в ДНК позвоночных. Поразительно, но при том что только около 3 % нуклеотидов C в ДНК человека подвергается метилированию, мутации
втаких метилированных нуклеотидах составляют приблизительно одну треть из числа всех единичных мутаций, которые выявлены у индивидов с наследственными болезнями.
5.4.6. В критических ситуациях в репарации ДНК участвуют специальные ДНК-полимеразы
Если ДНК клетки серьезно повреждена, то механизмы репарации, которые мы обсудили, зачастую оказываются недостаточно эффективными для того, чтобы справиться с нарушением. В таких случаях иная стратегия пускается в ход — и она сопряжена с определенным риском для клетки. Очень точные репликационные ДНК-полимеразы останавливаются, когда наталкиваются на поврежденную ДНК, и в критических ситуациях клетки используют многоцелевые, но менее точные резервные полимеразы для репликации поврежденной ДНК.
Клетки человека содержат более 10 таких ДНК-полимераз, некоторые из которых могут распознавать повреждения ДНК определенного типа и специфично добавлять нуклеотид, необходимый для восстановления изначальной последовательности. Остальные работают на уровне «верного предположения», особенно когда основание матрицы сильно повреждено. Эти ферменты не такие точные, как типичные репликационные полимеразы, копирующие типичную последовательность ДНК. Прежде всего, резервным полимеразам недостает функции экзонуклеолитической коррекции; кроме того, многие из них гораздо менее разборчивы, чем репликационная полимераза, в плане выбора нуклеотида, который необходимо включить в первую очередь. Возможно, по этой причине молекуле каждой такой полимеразы дан шанс добавить только один или несколько нуклеотидов. Хотя подробности этих завораживающих реакций все еще в стадии изучения, они предоставляют нам изящное свидетельство трогательной заботы, с которой организмы поддерживают целостность своей ДНК.
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 463
5.4.7. Репарация двухцепочечных разрывов проходит эффективно
Особенно опасны повреждения ДНК, при которых обе цепи двойной спирали разрываются, не оставляя неповрежденной матричной нити, которая могла бы обеспечить точность репарации. Ионизирующее излучение, ошибки репликации, окислители, а также иные продукты обмена веществ, производимые в самой клетке, вызывают разрывы подобного рода. Если бы такие повреждения оставались неустраненными, то они вскоре привели бы к дроблению хромосом на фрагменты меньшей длины и к потере генов при делении клетки. Однако в кузнице эволюции были выкованы два разных механизма, призванных исправлять повреждения такого рода (рис. 5.51). Наиболее прост для понимания механизм негомологичное соеди- нение концов (nonhomologous end-joining), при котором концы разрыва попросту сводятся вместе и воссоединяются лигированием ДНК, обычно с потерей одного или нескольких нуклеотидов на участке соединения (рис. 5.52). Такой механизм соединения концов, который можно было бы счесть сработанным «на скорую руку» решением для устранения двунитевых разрывов, весьма распространен в соматических клетках млекопитающих. Хотя на участке поломки неизбежно появляется изменение в последовательности ДНК (мутация), благодаря тому что малая доля генома млекопитающих кодирует белки, этот механизм является, очевидно, прием-
Рис.5.51.Дваразныхспособаустранениядвухцепочечныхразрывов.а)Негомологичноесоединение концов изменяет первоначальную последовательность ДНК при репарации разорванной хромосомы. Этиизменениямогутбытьиливформеделеций(какпоказано),иливвидекороткихвставок.б)Устранениедвухцепочечныхразрывовгомологичнойрекомбинациейосуществитьсложнее,ноприрепарации данноготипавоссоздаетсяоригинальнаяпоследовательностьДНК.Такоймеханизмобычноимеетместо после того, как ДНК была удвоена, но прежде, чем клетка разделится надвое. Подробно цепь реакций гомологичнойрекомбинациибудетобсуждатьсяпозже(см.рис.5.61).
464 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.5.52.Негомологичноесоединениеконцов.а)ГлавнуюрольиграетбелокKu—гетеродимер,который зажимаетконцыразорваннойхромосомы.Вспомогательныебелки,показанныездесь,необходимыдля удержанияразорванныхконцоввнепосредственнойблизости,покудаонипроцессируютсяивконечном итогесоединяютсяковалентно.б)ТрехмернаяструктурагетеродимераKu,связанногосконцомдвухцепо- чечногофрагментаДНК.БелокKuнеобходимтакжедляреанжировкиV(D)J—специфическогопроцесса рекомбинации, посредством которого в развивающихся B- и T-клетках создается разнообразие антител ирецепторовT-клеток(обсуждаетсявглаве25).МеханизмыреанжировкиV(D)Jинегомологичногосоеди- ненияконцовимеютмногообщего,нопервыйоснованнаспецифическихдвунитевыхразрывах,преднамереннопроизводимыхклеткой.(ИзображениебзаимствованоизJ. R. Walker,R. A. CorpinaandJ. Goldberg,
Nature412:607–614,2001.СвеликодушногодозволенияиздательстваMacmillanPublishersLtd.)
лемым решением проблемы воссоединения разорванных хромосом. К тому времени, когда человек достигает возраста 70 лет, типичная соматическая клетка содержит более 2 000 таких «шрамов», рассеянных по всему ее геному и показывающих места, в которых ДНК была не совсем точно репарирована путем негомологичного соединения концов. Как было сказано ранее, специализированная структура теломер предотвращает ошибочное распознавание естественных концов хромосом в качестве разорванной ДНК для дальнейшей репарации.
В новореплицированной ДНК устранение двухцепочечных разрывов происходит намного более точно (рис. 5.51, б). Здесь при репарации ДНК в качестве матрицы используется сестринская хроматида. Эта реакция являет собою пример гомоло-
гичной рекомбинации (homologous recombination), и мы рассмотрим ее механизм позже вэтой главе. Большинство организмов для устранения двунитевых разрывов в ДНК использует и негомологичное соединение концов, и гомологичную рекомби-
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 465
нацию. У человека преобладает негомологичное соединение концов; гомологичная рекомбинация используется только во время репликации ДНК и вскоре после нее (в S- и G2-фазах), когда сестринские хроматиды могут служить матрицами.
5.4.8. Повреждение ДНК задерживает ход клеточного цикла
Как мы только что убедились, клетки содержат многочисленные ферментные системы, которые способны распознавать и устранять повреждения ДНК многих типов. Ввиду важности поддержания целостной, неповрежденной ДНК из поколения в поколение клетки эукариот имеют дополнительный механизм, который максимизирует эффективность имеющихся в их распоряжении ферментов репарации ДНК: он задерживает ход клеточного цикла, пока репарация ДНК не будет завершена. Как подробно описывается в главе 17, планомерный ход клеточного цикла поддерживается с помощью контрольных точек (checkpoints), которые гарантируют строгую последовательность протекания очередных этапов без их взаимного наложения. В нескольких из таких контрольных точек клеточный цикл приостанавливается в случае обнаружения поврежденной ДНК. Так, в клетках млекопитающих наличие повреждения ДНК может блокировать переход из G1- в S-фазу, может замедлить S-фазу после ее начала и может блокировать переход из S-фазы в М-фазу. Такие задержки облегчают репарацию ДНК, предоставляя время, необходимое для полного завершения «ремонтных работ».
Повреждение ДНК индуцирует также усиленный синтез некоторых ферментов репарации ДНК. Важность специальных сигнальных механизмов, которые реагируют на повреждение ДНК, становится очевидной при взгляде на фенотип людей, которые рождены с дефектами в гене, который кодирует белок ATM. У этих индивидов развивается синдром Луи-Бар, или атаксия-телеангиэктазия (АТ; ataxia telangiectasia), — заболевание, которое проявляется в атрофии нервной системы, предрасположенности к раку и нестабильности генома. Белок ATM — крупная киназа, необходимая для выработки внутриклеточных сигналов, которые дают отклик на многие типы спонтанного повреждения ДНК, и поэтому индивиды с дефектами в этом белке страдают от последствий неустраненных повреждений ДНК.
Заключение
Генетическая информация может сохраняться неизменной в последователь- ностях ДНК только потому, что богатый набор ферментов репарации ДНК непрерывно сканирует ДНК и заменяет любые поврежденные нуклеотиды. Репарация ДНК большинства типов зависит от наличия отдельной копии гене- тической информации в каждой из двух цепей двойной спирали ДНК. Поэтому спонтанное повреждение в одной из цепей может быть вырезано ферментом репарации, и исправленная нить будет повторно синтезирована с учетом ин- формации, заключенной в неповрежденной нити.
Большинство повреждений в основаниях ДНК удаляется одним из двух основных способов репарации. При эксцизионной репарации оснований видоиз-
мененное основание удаляется ферментом ДНК-гликозилазой, за чем следует вырезание оголенного сахарофосфата. При эксцизионной репарации нуклеотидов маленький сегмент цепи ДНК, окружающий повреждение, удаляется из двойной спирали ДНК в виде олигонуклеотида. В обоих случаях разрыв, остающийся в спирали ДНК, заполняется последовательным действием ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы, использующих в качестве матрицы неповрежденную нить ДНК.
466 Часть 2. Основные генетические механизмы
Повреждения ДНК некоторых типов могут быть устранены при помощи иной стратегии — прямого химического исправления повреждения, которое осущест- вляется специализированными белками репарации.
Другие критические системы репарации — основанные либо на негомоло- гичном соединении концов, либо на гомологичной рекомбинации, — «сшивают» случайные двунитевые разрывы, которые появляются в спирали ДНК. В боль- шинстве клеток повышенный уровень повреждений ДНК вызывает задержку клеточного цикла, в чем задействован механизм контрольных точек; такая задержка гарантирует, что повреждение ДНК будет устранено до начала деления клетки.
5.5. Гомологичная рекомбинация
В двух предыдущих параграфах мы обсуждали механизмы, которые позволяют сохранять последовательности ДНК в клетках, от поколения к поколению, практически неизменными. В этом параграфе мы глубже исследуем один из таких механизмов — гомологичную рекомбинацию. Хотя гомологичная рекомбинация очень важна для точного устранения двунитевых разрывов (см. рис. 5.51, б) и повреждений ДНК других типов, она, как мы увидим, может также перестраивать последовательности ДНК. Такие перестройки часто видоизменяют конкретные варианты генов, присутствующие в отдельном геноме, равно как и хронометраж, и уровень их экспрессии. Для любой популяции генетическая изменчивость, обусловленная этим и другими типами генетической рекомбинации, — жизненно важный процесс, направленный на облегчение эволюции организмов в ответ на изменения в окружающей среде.
5.5.1. Гомологичная рекомбинация находит в клетке множество применений
При гомологичной рекомбинации (известной также как общая рекомбинация)
имеет место генетический обмен между парой гомологичных последовательностей ДНК, то есть последовательностей ДНК, подобных или идентичных по последовательности нуклеотидов. Гомологичная рекомбинация служит множеству целей
вклетке, но три направления действия имеют первостепенное значение. Наиболее распространенное ее применение состоит в точном устранении двухцепочечных разрывов, с которым мы ознакомились в предыдущем параграфе (рис. 5.51, б). Хотя двухцепочечные разрывы могут образоваться в результате действия радиации и химически активных веществ, многие представляют собой продукты застопоривания или разрушения репликационных вилок ДНК. Это применение гомологичной рекомбинации существенно для каждой пролиферирующей клетки, потому что аварии происходят почти при каждом цикле репликации ДНК.
Самые разные события могут повлечь за собой поломку репликационной вилки
входе процесса репликации. Рассмотрим только один пример: однонитевой разрыв или брешь в родительской спирали ДНК сразу перед репликационной вилкой. Когда вилка достигает этого повреждения, она разваливается и дает одну разорванную и одну интактную дочерние хромосомы. Однако ряд реакций рекомбинации, который может начинаться с процесса внедрения (вторжения) цепи, или инвазии (strand invasion), и запускать синтез ДНК ДНК-полимеразой, может безупречно восстановить разорванную хромосому (рис. 5.53).
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 467
Рис.5.53.Восстановлениеразрушеннойрепликационнойвилкиприпомощигомологичнойрекомбинации.
Когдадвижущаясярепликационнаявилканаталкиваетсянаодноцепочечныйразрыв,онаразрушается,номожетбытьвосстановленагомологичнойрекомбинацией. Какпоказанонасхеме,дляначалапроцессавнедрения цепи (инвазии цепи) требуется свободный 3'-конец, которыйобразуетсяподдействиемнуклеазы,гидролизующей комплементарную нить с 5'-конца. Затем, как толькопроизошлаинвазия,начинаетсярекомбинация, что детально представлено в последующих рисунках. Стрелкипоказывают3'-концынитейДНК.Зеленымцве- том отмечены цепи новосинтезированной ДНК — они синтезированы после того, как репликационная вилка быларазрушена.Обратитевнимание,чтовэтоммеханизме вилка минует участок разрыва на исходной матрице,используянеповрежденнуюкопиюэтогоучастка в качестве матрицы. (Переработано из M. M. Cox, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 8173–8180, 2001. С любезного разрешенияNationalAcademyofScience.)
Вдобавок к этому гомологичная рекомбинация используется для обмена генетической информацией между двумя различными
хромосомами — чтобы создать новые сочетания последовательностей ДНК в каждой из хромосом. Потенциальная эволюционная
«выгода» от такого типа смешения генов заключается в том, что оно создает серию новых, возможно выгодных, сочетаний генов. Во время мейоза у грибов, растений
и животных гомологичная рекомбинация играет также важную механическую роль, которая заключается в обеспечении точного расхождения хромосом. В этом параграфе мы рассматриваем лишь универсальные задачи гомологичной рекомбинации, к кото-
рым относят устранение повреждений ДНК и опосредование генетического обмена. Более специализированная — механическая — функция, которая проявляется при расхождении хромосом во время мейоза, будет обсуждена в главе 21.
5.5.2. Фундаментальные механизмы гомологичной рекомбинации, общие для всех клеток
Существующее представление о гомологичной рекомбинации как о критически важном механизме репарации ДНК во всех клетках развивалось медленно на почве ее первоначального открытия как ключевого компонента в специализированном процессе мейоза в растениях и животных. После открытия, что гомологичная рекомбинация происходит также и в менее сложных одноклеточных организмах, интерес биологов к ее исследованию значительно возрос. Таким образом, бóльшая часть того, что мы