488 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.5.69.Транспозицияпомеханизмувырезанияивставки.ДНК-транспозонымогутбытьидентифи-
цированы в хромосомах по «последовательностям инвертированных повторов ДНК» (красные) на их концах.Этипоследовательности,которыемогутбытьнедлиннее20нуклеотидов,представляютсобой все,чтонеобходимодлятранспозициизажатоймеждунимиДНКопределеннымферментом—транс- позазой, кодируемой этим подвижным элементом. Перемещение способом вырезания и вставки ДНК-транспонируемогоэлементаизодногоучасткахромосомывдругойначинается,когдатранспозаза сводитдвеинвертированныепоследовательностиДНКдругсдругом,формируяпетлюДНК.Встраивание вцелевуюхромосому,катализируемоетранспозазой,происходитнаслучайномучастке—посредством созданияступенчатыхразрезоввхромосоме-мишени(красныестрелки).Послереакциитранспозиции однонитевые промежутки, образовавшиеся в результате ступенчатых разрывов, устраняются ДНКполимеразой и ДНК-лигазой (черный). В результате участок вставки «помечается» коротким прямым повторомцелевойпоследовательностиДНК,какпоказанонарисунке.Хотяразрыввдонорнойхромосоме (зеленая) устраняется, этот процесс часто видоизменяет последовательность ДНК, создавая мутацию научастке,скоторогобылвырезантранспонируемыйэлемент(непоказана).
случае транспозон не будет водружен на прежнее место, но на участке репарации может произойти утрата гетерозиготности. Как третья возможность, реакция негомологичного соединения концов может запечатать зазор; в этом случае последовательность ДНК, которая первоначально окружала транспозон, видоизменяется, и на хромосомном участке, из которого этот транспозон был вырезан, возникает мутация (см. рис. 5.52).
Что примечательно, тот же механизм вырезания и вставки, что используется для вырезания из ДНК транспозонов, обнаружен в развивающихся иммунных системах позвоночных животных, где он используется в катализе перестроек ДНК, лежащих в основе многообразия антител и разнообразия T-клеточных рецепторов. Известный под названием V(D)J-рекомбинации, этот процесс будет обсужден в главе 25. Встречающаяся только у позвоночных V(D)J-рекомбинация представляет собой сравнительно недавно появившуюся эволюционную новинку, но она, как полагают, эволюционировала от намного более древних транспозонов «вырезания и вставки».
Некоторые ДНК-транспозоны перемещаются посредством механизма, названного репликативной транспозицией. В этом случае ДНК транспозона репли-
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 489
Рис.5.70.Структураглавногопромежуточногопродукта,образуемоготранспозазой«вырезанияивстав-
ки».а)Схематичноепредставлениеобщейструктуры.б)Детальнаяструктуратранспозазы,удерживающей дваконцаДНК,3'-OH-группыкоторойподготовленыдлявзаимодействиясцелевойхромосомой.Один доментранспозазыраспознаетпоследовательностьДНКнаконцетранспозона,тогдакакдругойдомен «руководит всей химической кухней» разрыва и воссоединения ДНК (Изображение б заимствовано изD. R. Daviesetal.,Science289:77–85,2000.СлюбезногоразрешенияиздательстваAAAS.)
цируется в ходе транспозиции: одна копия остается на первоначальном участке, тогда как другая встраивается в новую позицию в хромосоме. Хотя используемый в этом случае механизм более сложен, он тесно связан с только что описанным механизмом вырезания и вставки; на самом деле, некоторые транспозоны могут передвигаться обоими способами.
5.6.3. Некоторые вирусы используют механизм транспозиции для переноса своего генетического материала в хромосомы клетки хозяина
Некоторые вирусы относят к мобильным генетическим элементам, потому что они используют механизмы транспозиции для интегрирования своих геномов в геном клетки-хозяина. Однако, в отличие от транспозонов, такие вирусы кодируют и белки, упаковывающие их генетическую информацию в вирусные частицы, которые могут инфицировать другие клетки. Многие из вирусов, которые встраиваются в хромосому хозяина, делают это, используя один из первых двух механизмов, приведенных в таблице 5.3. Действительно, большая часть наших знаний об этих механизмах получена в ходе исследований конкретных вирусов.
Вирус, который заражает бактерию, известен как бактериофаг (bacteriophage). Бактериофаг Mю (bacteriophage Mu) для интеграции своего генома в геном клеткихозяина использует не только основанную на ДНК транспозицию, но также и репликативную транспозицию для реплицирования своего генома. Транспозиция играет ключевую роль также в жизненном цикле многих других вирусов. Наибольшего внимания заслуживают ретровирусы (retroviruses), к которым относится и вирус AIDS (СПИД) человека, HIV (ВИЧ). Вне клетки ретровирус существует в виде одноцепочечного РНК-генома, упакованного в белковый капсид вместе с кодируемым
490 Часть 2. Основные генетические механизмы
вирусом ферментом обратной транскриптазой. Во время процесса инфицирования вирусная РНК вводится в клетку и конвертируется в молекулу двухцепочечной ДНК — благодаря действию этого важнейшего фермента, который способен полимеризовать ДНК как на матрице РНК, так и на матрице ДНК (рис. 5.71 и 5.72). В термине ретровирус отмечена способность такого вируса обращать вспять закономерный поток генетической информации, который обычно направлен от ДНК к РНК (см. рис. 1.5).
Как только обратная транскриптаза произвела на свет молекулу двухцепочечной ДНК, специфические последовательности вблизи обоих ее концов удерживаются вместе кодируемой вирусом транспозазой, называемой интегразой. Интеграза создает активированные 3′-OH-концы вирусной ДНК, которые могут непосредственно взаимодействовать с молекулой ДНК-мишени по механизму, подобному используемому ДНК-транспозонами — механизму вырезания и вставки (рис. 5.73). Фактически, доскональные исследования трехмерных структур транспозаз бактерий и интегразы ВИЧ выявили поразительное сходство этих ферментов, даже при том, что их аминокислотные последовательности далеко разошлись друг от друга.
Рис. 5.71. Жизненный цикл ретровируса. Геном ретровируса состоит из молекулы РНК длиной около 8 500нуклеотидов;вкаждойвируснойчастицеобычноупакованыдветакиемолекулы.Ферментобратная транскриптаза сначала делает ДНК-копию молекулы вирусной РНК, а затем и вторую нить ДНК, таким образомпроизводякопиюРНК-геномавирусаввидедвухцепочечнойДНК.Затемкодируемыйвирусом фермент интеграза катализирует встраивание этой двойной спирали ДНК в хромосому хозяина (см. рис.5.73).ТакоевстраиваниенеобходимодлясинтезановыхмолекулвируснойРНКРНК-полимеразой клетки-хозяина—ферментом,которыйтранскрибируетРНКнаматрицеДНК(обсудимвглаве6).
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 491
Рис.5.72.Обратнаятранскриптаза.а)ТрехмернаяструктураферментаизВИЧ(вирусаСПИДчеловека), определеннаяспомощьюрентгеновскойкристаллографии.б)Модель,показывающаяработуфермента наматрицеРНК.Обратитевнимание,чтодоменполимеразы(желтыйнаизображенииб)имеетковалентно присоединенный домен РНКазы H (H означает «гибридный») (красный), который деградирует нитьРНКвгибриднойспиралиРНК–ДНК.Этодействиепомогаетполимеразепревращатьпервоначаль- ную гибридную спираль в двойную спираль ДНК (Изображение а любезно предоставлено Tom Steitz;
изображение б переработано из L. A. Kohlstaedt et al., Science 256: 1783–1790, 1992. С великодушного разрешенияиздательстваAAAS.)
5.6.4. Ретровирус-подобные ретротранспозоны напоминают ретровирусы, но у них отсутствует белковая оболочка
Большое семейство транспозонов, называемых ретровирус-подобными ретротран-
спозонами (retroviral-like retrotransposons; см. таблицу 5.3), перемещается в хромосомы
ииз хромосом за счет механизма, который идентичен используемому ретровирусами. Такого рода мобильные элементы встречаются в разных организмах: у дрожжей, мух
имлекопитающих; в отличие от вирусов, им не свойственна способность покидать хозяйскую клетку, и они передаются всем потомкам этой клетки через нормальный процесс репликации ДНК и деления клеток. Первый шаг в их транспозиции — транскрипция транспозона целиком с получением РНК-копии мобильного элемента, который обычно имеет длину несколько тысяч нуклеотидов. Этот транскрипт, который транслируется клеткой-хозяином как обычная матричная РНК, кодирует фермент обратную транскриптазу. Этот фермент синтезирует двухцепочечную ДНК-копию молекулы РНК через образование промежуточного продукта — гибрида РНК-ДНК, что зеркально отражает ранние стадии инфицирования ретровирусами (см. рис. 5.71). Как и у ретровирусов, молекула линейной двухцепочечной ДНК после этого встраивается в участок на хромосоме, прибегнув к содействию фермента интегразы, который также кодируется мобильным элементом (см. рис. 5.73).
5.6.5. Большая доля генома человека состоит из неретровирусных ретротранспозонов
Значительная часть многих хромосом позвоночных состоит из повторяющихся последовательностей ДНК. В хромосомах человека такие повторы в большинстве
492 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.5.73.Транспозиция,осуществляемаялиборетровирусом(типаВИЧ),либоретровирус-подобным ретротранспозоном.ПроцессначинаетсясмолекулыдвухцепочечнойДНК(оранжевая),синтезируемой обратнойтранскриптазой(см.рис.5.71).НаначальномэтапеферментинтегразаформируетпетлюДНК иразрезаетоднунитьнакаждомконцепоследовательностивируснойДНК,высвобождаяновые3'-OH- группы.Затем каждыйизтаких3'-OH-концов напрямуюатакуетфосфодиэфирнуюсвязьнапротивоположных цепях произвольно выбранного участка на хромосоме-мишени (красные стрелки на синей ДНК).ТемсамымосуществляетсявстраиваниепоследовательностивируснойДНКвхромосому-мишень, при этом по обе стороны от встроенного сегмента остаются короткие прорехи, которые заполняются в ходепроцессоврепарацииДНК.Всвязисиспользованиеммеханизма«заполнениябрешей»(подобно таковому при транспозиции «вырезанием и вставкой») с обеих сторон встроенного в ДНК сегмента остаютсякороткиеповторыцелевойДНК(черные).
своем представлены мутированными и усеченными версиями неретровирусных ретротранспозонов (nonretroviral retrotransposons), относящихся к третьему главному типу транспозонов (см. таблицу 5.3). Хотя большинство таких транспозонов неподвижно, немногие сохранили способность передвигаться. Относительно недавно установлены перемещения элемента L1 (иногда называемого LINE, или long interspersed nuclear element), часть из которых вызывает болезни человека; например, особый тип гемофилии обусловлен вставкой элемента L1 в ген, кодирующий белок свертывания крови (фактор VIII) (см. рис. 6.25).
Неретровирусные ретротранспозоны встречаются во многих организмах и перемещаются при помощи совершенно иного механизма — для которого требуется комплекс эндонуклеазы и обратной транскриптазы. Как показано на рис. 5.74, в случае неретровирусных ретротранспозонов РНК и обратная транскриптаза в событии рекомбинации участвуют непосредственно и играют гораздо большую роль, чем в случае ретровирус-подобных ретротранспозонов, описанных выше.
Анализ последовательности генома человека показал, что большая часть неретровирусных ретротранспозонов — например, многочисленные копии элемента Alu, члена
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 493
Рис. 5.74. Транспозиция неретровирусного ретро-
транспозона.ТранспозициямобильногоэлементаL1 (красный) начинается, когда эндонуклеаза элемента L1,присоединеннаякL1 обратнойтранскриптазе(зеленыйовал)иL1 РНК(синяя),надрезаетцелевуюДНК в точке, где произойдет встраивание. В результате этого расщепления в ДНК-мишени высвобождается 3'-OH-конец,которыйзатемиспользуетсякакзатравка для этапа обратной транскрипции. В итоге создается представленнаяодноцепочечнойДНКкопияподвижногоэлемента,котораяковалентносвязанасцелевой ДНК.Входепоследующихреакцийнаодноцепочечной ДНКсинтезируетсяноваякопия;врезультатеполучаетсядвухцепочечнаяДНКэлементаL1,котораявстроена научасткепервоначальногонадреза.
семейства SINE (short interspersed nuclear elements), — не несет своих собственных генов эндонуклеазы или обратной транскрип- тазы. Однако им удалось успешно размно- житься и стать главными компонентами на- шего генома, предположительно, захватывая (и переманивая на свою сторону) ферменты, кодируемые другими транспозонами.
Элементы L1 и Alu, кажется, размножи- лись в геноме человека сравнительно недавно (рис. 5.75). Так, например, мышь содержит последовательности, близкородственные эле- ментам L1 и Alu, но их размещение в хромо- сомах мыши отличается от такового в хромо- сомах человека (см. рис. 4.80). Вместе взятые LINE и SINE составляют приблизительно 40 % генома человека (см. рис. 4.17).
5.6.6. В геномах различных организмов преобладают разные транспонируемые элементы
Итак, мы описали транспонируемые элементы нескольких типов: 1) ДНКтранспозоны, передвижение которых основано на реакциях разрыва и соединения ДНК; 2) ретровирус-подобные ретротранспозоны, которые тоже передвигаются посредством разрыва и соединения ДНК, но здесь ключевая роль, как матрицы для изготовления катализатора рекомбинации ДНК, принадлежит РНК; и 3) не- ретровирусные ретротранспозоны, в которых РНК-копия мобильного элемента является основным звеном, необходимым для включения подвижного элемента в ДНК мишень, ибо служит прямой матрицей для события обратной транскрипции c затравкой на целевой ДНК.
Что занимательно, в геномах различных организмов преобладают транспозоны разного типа. Например, подавляющее большинство транспозонов бактерий пред-
494 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 5.75. Распространение обогащенных элементами Alu и В1 последовательностей, встречающихся в геномах соответственно человека и мыши. Обе эти транспонируемые последовательности ДНК, как думают, начали свойэволюционныйпутьотгена7SLРНК,которыйкодируетSRPРНК(см.рис.12.39).Исходя из их позиций в этих двух геномах и подобия последовательностейэтихчастоповторяющихся элементов, можно заключить, что основное увеличение числа копий, кажется, происходило независимо у мыши и у человека (см. рис. 4.80). (Переработано на основе P. L. Deininger and G. R. Daniels, Trends Genet. 2: 76–80,
1986, с любезного разрешения издательства
Elsevier, и на основе International Human Genome Sequencing Consortium, Nature 409:
860–921, 2001, с великодушного дозволения издательстваMacmillanPublishersLtd.)
ставлено только ДНК-типами, в число которых затесалась лишь малая горстка, относящаяся к неретровирусным ретротранспозонам. У дрожжей основными мобильными элементами являются ретровирус-подобные ретротранспозоны. У дрозофилы встречаются транспозоны ДНК, ретровирусные и неретровирусные. Наконец, геном человека содержит транспозоны всех трех типов, но, как мы покажем ниже, истории их эволюции разительно отличаются одна от другой.
5.6.7. Последовательности генома раскрывают приблизительные временны' е рамки перемещения транспонируемых элементов
Нуклеотидная последовательность генома человека предоставляет нам богатую «историческую сводку» о деятельности транспозонов во временном масштабе эволюции. На основании скрупулезного сравнения нуклеотидных последовательностей приблизительно 3 миллионов «останков» транспонируемых элементов
вгеноме человека стало возможным в общих чертах восстановить передвижения транспозонов в геномах наших предков за последние несколько сотен миллионов лет. Например, ДНК-транспозоны, по-видимому, были очень активны задолго до расхождения людей и обезьян Старого Света (25–35 миллионов лет назад); но, поскольку они постепенно накапливали инактивирующие мутации, то пребывали с тех пор в дремлющем состоянии в генеалогической линии человека. Аналогично, хотя наш геном засорен остатками ретровирус-подобных транспозонов, ни один из них не проявляет видимой активности. Только одно семейство ретровирус-подобных ретротранспозонов, как полагают, перекочевало в геном человека после расхождения человека и шимпанзе приблизительно 6 миллионов лет назад. Неретровирусные ретротранспозоны также являются древними, но, в отличие от остальных типов, некоторые все еще перемещаются в нашем геноме, как было упомянуто ранее. Например, по оценкам, de novo передвижение элемента Alu наблюдается один раз на каждые 100–200 человеческих поколений. Передвижки неретровирусных ретротранспозонов ответственны за малую, но существенную долю новых мутаций
вгеноме человека — возможно, две мутации из каждой тысячи.
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 495
Ситуация у мышей во многом отличается. Хотя геномы мыши и человека содержат примерно одинаковую плотность транспозонов этих трех типов, ретротранспозоны двух типов все еще активно транспонируются в геноме мыши и берут на себя ответственность за появление около 10 % новых мутаций.
Хотя мы только начинаем понимать, как именно передвижение транспозонов сформировало геномы современных млекопитающих, предполагается, что всплески активности транспозонов послужили причиной определяющих событий видообразования в процессе расхождения эволюционных линий млекопитающих от общего предка — процесс, который начался приблизительно 170 миллионов лет назад. На данный момент мы можем лишь задаваться вопросом о том, сколько наших исключительно человеческих «достоинств» возникло как результат деятельности многочисленных подвижных генетических элементов в прошлом, останки которых сегодня разбросаны по нашим хромосомам.
5.6.8. Консервативная сайт-специфическая рекомбинация может привести к обратимой перестройке ДНК
Механизм рекомбинации иного рода, известный как консервативная сайт- специфическая рекомбинация, опосредует перестройки мобильных элементов ДНК других типов. В этом способе разрыв и соединение происходят на двух специальных участках, по одному на каждой из взаимодействующих молекул ДНК. В зависимости от позиций и относительных ориентаций этих двух участков рекомбинации может произойти встраивание ДНК, вырезание ДНК или инверсия ДНК (рис. 5.76). Консервативная сайт-специфическая рекомбинация осуществляется специализированными ферментами, которые разрывают и воссоединяют две двойные спирали ДНК в специфических последовательностях на каждой из молекул ДНК. Та же ферментативная система, которая соединяет две молекулы ДНК, может часто вновь их обособить, точно восстанавливая последовательность двух исходных молекул ДНК (см. рис. 5.76, а).
Несколько особенностей отличает консервативную сайт-специфическую рекомбинацию от транспозиции. Во-первых, консервативная сайт-специфическая рекомбинация требует наличия специализированных последовательностей (сайтов) как на донорной, так и на акцепторной ДНК (отсюда термин «сайт-специфическая»). Эти последовательности содержат опознавательные участки для специфической рекомбиназы, которая «берется» за катализ перестройки. В отличие от сайт-специфической рекомбинации, при транспозиции требуется только наличие специализированной последовательности на транспозоне, при этом для большинства транспозонов последовательность акцепторной ДНК не важна. Во-вторых, механизмы реакции в основе своей различны. Рекомбиназы, которые катализируют консервативную сайт-специфическую рекомбинацию, напоминают топоизомеразы — в том смысле, что они образуют кратковременные высокоэнергетические ковалентные связи с ДНК и используют эту энергию для завершения перестроек ДНК. Таким образом, все фосфатные связи, которые разрываются во время события рекомбинации, восстанавливаются по его завершении (отсюда термин «консервативная»). Транспозиция, напротив, основана на реакции переэтерификации, в ходе которой не образуется промежуточного звена в виде ковалентно связанных ДНК и белка. Этот процесс оставляет в ДНК однонитевые пробелы, которые должны быть вновь заштопаны ДНК-полимеразой и ДНК-лигазой — ферментами, которые требуют энергетической подпитки, поступающей от гидролиза нуклеотидов.
496 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.5.76.ПерестройкиДНКдвухтипов,которыепроисходятприконсервативнойсайт-специфической рекомбинации. Единственное отличие между реакциями на схемах а и б кроется в относительной ориентации двух коротких участков ДНК (обозначенных стрелками), в которых происходит событие сайт-специфической рекомбинации. а) В ходе реакции интеграции кольцевая молекула ДНК может быть включена во вторую молекулу ДНК; посредством обратной реакции (вырезания) она может высвободитьсяивновьобразоватьпервоначальноекольцоДНК.Многиебактериальныевирусы«входят»
вхромосомы хозяина и «выходят» из них таким вот способом (см. рис. 5.77). б) Консервативная сайтспецифическая рекомбинация может также инвертировать определенный сегмент ДНК в хромосоме. ХорошоизвестныйпримеринверсииДНКпосредствомсайт-специфическойрекомбинациинаблюдается
вбактерииSalmonellatyphimurium,котораячастобываетпричинойпищевогоотравленияулюдей;инверсиясегментаДНКизменяеттипжгутика,которыйпродуцируетсяэтойбактерией(см.рис.7.64).
5.6.9. Консервативная сайт-специфическая рекомбинация была открыта на бактериофаге λ
Вирус бактерий, бактериофаг λ, — первый подвижный ДНК элемент, который был охарактеризован с точки зрения биохимии «от и до». Когда этот вирус попадает в клетку, он направляет синтез кодируемого вирусом фермента рекомбиназы, названного λ-интегразой. Этот фермент опосредует ковалентное присоединение вирусной ДНК к хромосоме бактерии, в результате чего вирус становится частью этой хромосомы и реплицируется автоматически — как часть ДНК хозяина. Процесс рекомбинации начинается, когда несколько молекул белка интегразы прочно связываются со специфической последовательностью ДНК на кольцевой хромосоме бактериофага, наряду с несколькими белками хозяина. После этого такой ДНКбелковый комплекс может связаться в участке прикрепления на ДНК бактериальной хромосомы, сводя хромосому бактерии с хромосомой бактериофага воедино. Затем интеграза катализирует требуемые реакции разрезания и сшивки, каковые имеют место в процессе рекомбинации. Из-за короткой области гомологии последовательностей в двух объединяемых последовательностях в этой точке обмена формируется крошечное гетеродуплексное сочленение (рис. 5.77).
Тот же вариант механизма сайт-специфической рекомбинации задействован при высвобождении ДНК бактериофага λ с участка ее интеграции на хромосоме E. coli — в ответ на определенные сигналы, — для стремительного размножения в бактериальной клетке (рис. 5.78). Вырезание катализируется комплексом
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 497
Рис. 5.77. Встраивание кольцевой хромосомы ДНК бактериофага λ в хромосому бактерии. В дан-
ном примере консервативной сайт-специфической рекомбинации фермент λ-интеграза связывается соспецифичнойпоследовательностьюДНК,определяющейучасток(сайт)егоприкреплениянакаждой хромосоме,иделаетразрезы,вкоторыевстраиваетсякороткаягомологичнаяпоследовательностьДНК. Послеэтогоинтегразараскручиваетпартнерскиецепиивновьзалечиваетих,образуягетеродуплексное сочленение длиной в семь пар нуклеотидов. В общей сложности требуется четыре реакции (разрыва и соединения нитей); для каждой из них энергия расщепленной фосфодиэфирной связи запасается вковалентныхсвязях,образующихсявпереходномсостояниимеждуДНКиферментом,такчтодляза- делываниянитиДНКнетребуетсяприсутствияATPилиДНК-лигазы.
фермента интегразы и хозяйских факторов4 со вторым белком бактериофага, эксцизионазой5, который производится вирусом, только когда клетка его хозяина претерпевает стресс, — в таком случае в интересах бактериофага покинуть клетку хозяина и снова размножаться в виде вирусной частицы.
5.6.10. Консервативная сайт-специфическая рекомбинация может быть использована для включения и выключения генов
Когда участки, специфично узнаваемые ферментом консервативной сайт-спе- цифической рекомбинации, инвертируются в своей ориентации, последовательность
4 Встраивания. — Прим. перев.
5 Эксцизионная гидролаза; вырезает сегменты ДНК из хромосом. — Прим. ред.
