Volume1

578 Часть 2. Основные генетические механизмы

терпевая при этом конформационные изменения. У бактерий эти факторы названы EF-Tu и EF-G, а у эукариот — EF1 и EF2. В некоторых условиях in vitro рибосомы могут синтезировать белки в отсутствие этих факторов элонгации и гидролиза GTP, но такой синтез проходит очень медленно, неэффективно и неточно. Сопряжение движимых гидролизом GTP конформационных изменений в факторах элонгации с переходами между различными состояниями в рибосоме чрезвычайно ускоряет синтез белка. Хотя такие состояния рибосомы еще до конца не поняты, они почти наверняка сопряжены со структурными перестройками РНК в рибосомном коре. Циклы связывания с факторами элонгации, гидролиза GTP и диссоциации гарантируют, что все такие изменения происходят в направлении «вперед», с тем чтобы трансляция могла проходить эффективно (рис. 6.67).

Как было показано ранее, EF-Tu одновременно связывает GTP и молекулы аминоацил-тРНК (см. рис. 3.74). Кроме помощи по продвижению трансляции вперед, EF-Tu (EF1 у эукариот) увеличивает точность трансляции несколькими способами. Во-первых, когда EF-Tu препровождает подаваемую к рибосоме аминоацилтРНК, он проверяет, является ли соответствие тРНК–аминокислота верным. Как именно это происходит, точно не известно. По одной из гипотез, правильные пары тРНК–аминокислота обладают узкоспецифичным сродством к EF-Tu, что позволяет EF-Tu разбираться, хотя и грубо, во множестве различных комбинаций аминокислота–тРНК и избирательно подхватывать по пути в рибосому только правильные связки. Во-вторых, EF-Tu отслеживает первичное взаимодействие между антикодоном подходящей аминоацил-тРНК и кодоном мРНК в A-участке. Молекулы аминоацил-тРНК «изогнуты», будучи связаны с GTP-формой EF-Tu; такая изогнутая конформация допускает спаривание кодона, но препятствует включению аминокислоты в наращиваемую полипептидную цепь. Однако, если соответствие кодон–антикодон оказывается верным, то рибосома быстро запускает гидролиз молекулы GTP, по завершении которого EF-Tu разрывает свою связь с тРНК и отделяется от рибосомы, позволяя тем самым молекуле тРНК пожертвовать свою аминокислоту на синтез белка. Но как оценивается собственно «правильность» соответствия кодон–антикодон? Столь тонкую задачу выполняет сама рибосома при помощи основанного на РНК механизма. рРНК малой субъединицы рибосомы образует ряд водородных связей с парой кодон–антикодон, что позволяет определить ее правильность (рис. 6.68). По сути, рРНК обертывается вокруг пары кодон–антикодон, и ее окончательное замыкание — которое происходит только тогда, когда там находится верный антикодон, — запускает гидролиз GTP. Примечательно, что такой механизм «вынужденного соответствия» способен различать верные и неверные взаимодействия типа кодон–антикодон, несмотря на действие правил «нестрогого спаривания оснований», подытоженных на рис. 6.53. На основании данного примера, равно как и сплайсинга РНК, можно получить представление о в высшей степени сложных формах молекулярного узнавания, которого удается достичь лишь исключительно с привлечением РНК.

Только что описанные взаимодействия EF-Tu, тРНК и рибосомы дополняют критически важными корректирующими операциями процесс синтеза белка на начальном этапе выбора тРНК. Но после того как GTP гидролизуется, а EF Tu отделится от рибосомы, у нее есть дополнительная возможность предотвратить попадание неправильной аминокислоты в наращиваемую цепь. Сразу за гидролизом GTP следует короткая временнáя пауза — пока аминокислота, принесенная тРНК, занимает свое положение в рибосоме. Эта задержка во времени короче для

580 Часть 2. Основные генетические механизмы

Рис. 6.68. Распознавание правильных кодон-антикодоновых пар молекулой рРНК малой субчастицы рибосомы. Показано взаимодействие между нуклеотидом рРНК малой субчастицы ипервойпаройдолжнымобразомспаренныхнуклеотидовкодонасантикодоном;подобныевзаимодействияпроисходятмежду остальными нуклеотидами рРНК и второй, а также третьей по- зициямивпарекодон–антикодон.МолекуларРНКмалойсубча- стицыможетобразовыватьтакуюсетьводородныхсвязейтолько с правильно сопряженными парами кодон–антикодон. Как поясняется в тексте, такое отслеживание пар кодон–антикодон, осуществляемое рРНК малой субчастицы, повышает точность синтеза белка. (Заимствовано из J. M. Ogle et al., Science 292: 897–902,2001.СлюбезногоразрешенияиздательстваAAAS.)

6.2.9.  Рибосома представляет собой рибозим

Рибосома — крупный комплекс, состоящий на две трети из РНК и на одну треть из белка. Определение в 2000 г. полной трехмерной конформации ее большой и малой субчастиц — главный успех современной структурной биологии. Полученные результаты подтверждают предыдущие данные о том, что именно молекулы рРНК — а не белки — отвечают за общую структуру рибосомы, за ее способность располагать молекулы тРНК на мРНК и за ее каталитическое действие в отношении образования ковалентных пептидных связей. Рибосомные РНК свернуты в очень компактные, точные трехмерные структуры, которые формируют компактное ядро, или каркас (кор), рибосомы и определяют ее форму в целом (рис. 6.69).

В противоположность главенствующему положению молекул рРНК, занявших все центральные позиции, рибосомные белки обычно находят себе пристанище на периферии или ютятся в промежутках между свернутыми молекулами РНК (рис. 6.70). Вытянутые полипептидные участки цепи некоторых из этих белков проникают в расселины в РНК-вом коре (рис. 6.71). Главная роль рибосомных белков, по-видимому, состоит в стабилизации каркаса РНК при сохранении возможности изменений в конформации рРНК, которые необходимы ей для эффективного катализа синтеза белка. Эти белки, вероятно, помогают также и в первичной сборке молекул рРНК, образующих рибосомный каркас.

Мало того, что А-, P- и E-участки связывания молекул тРНК формируются главным образом рибосомными РНК, каталитический сайт образования пептидных связей тоже сформирован из РНК, поскольку ближайшая аминокислота отстоит от него более чем на 1,8 нм.

Это открытие стало полной неожиданностью для биологов, потому что, в отличие от белков, РНК не содержит легко ионизируемых функциональных групп, которые могут быть использованы для катализа замысловатых реакций типа образования пептидной связи. Более того, ионы металлов, которые часто используются молекулами РНК для катализа химических реакций (о чем мы поговорим позже

вэтой главе), не были обнаружены в активном центре рибосомы. Полагают, что, вместо этого, 23S рРНК формирует сильно структурированный карман, который при помощи сети водородных связей точно ориентирует два реагента (растущую пептидную цепь и аминоацил-тРНК) и таким образом значительно ускоряет их ковалентное соединение. Вдобавок к этому тРНК, находящаяся в P-сайте, входит

вактивный центр и, возможно, предоставляет функционально активную группу ОН,

Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 581

Рис. 6.69. Структура молекул рРНК в большой субчастице бактериальной рибосомы, установленная при помощи рентгеноструктурного анализа. а) Трехмерные структуры молекул рРНК (5S и 23S) большой субчастицы, в которых они находятся в составе рибосомы. Также показана одна из белковых субъединиц рибосомы(L1)вкачествеориентира, таккаконаобразуетхарактерноевыпячивание на рибосоме. б) Схематичное представление вторичной структуры 23S рРНК с обширной сетью спаренных участков. Структура была разделена на шесть доменов, цвета которых соответствуют таковым на изображении а. Схема вторичной структуры сильно упрощена, чтобы представить структуру наиболеенаглядно—насколькоэто возможно—вдвухизмерениях.Для этого в цепь РНК внесено несколько разрывов, хотя в действительности 23SрРНКпредставляетсобойединую молекулуРНК.Например,нуклеотидная цепь главной части домена III плавно переходит в домен IV, хотя в соответствующем месте на схеме и зияет промежуток. (Переработано на основе N. Ban et al., Science 289:

905–920, 2000. С любезного разрешенияиздательстваAAAS.)

которая непосредственно участвует в катализе. Этот механизм может гарантировать, что катализ произойдет толь-

ко тогда, когда тРНК будет должным образом размещена в рибосоме. Молекулы РНК, которые обладают каталитической активностью, известны

под названием рибозимов (ribozymes). Ранее в этой главе мы видели, как другие рибозимы действуют в реакциях самосплайсинга (например, см. рис. 6.36). В заключительном параграфе этой главы мы рассмотрим вопрос о том, какое значение способность молекул РНК быть катализаторами различных реакций могла иметь на этапе ранней эволюции живых клеток. Пока же мы просто обращаем внимание, что есть серьезное основание подозревать, что именно молекулы РНК, а не белка, были первыми катализаторами в живых клетках. Если это так, то рибосома с ее РНК-ядром может быть реликтом давно минувших дней в истории жизни — когда синтез белка эволюционировал в клетках, где было почти полное господство рибозимов.

Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 583

пункт, в котором клетка может решить, нужно ли транслировать эту мРНК и синтезировать этот белок. Таким образом, скорость инициации есть одна из детерминант скорости, с которой синтезируется любой белок. В главе 7 мы увидим, что клетки используют несколько механизмов регуляции инициации трансляции.

Трансляция мРНК начинается с кодона AUG, и для запуска трансляции необходима специальная тРНК. Такая инициаторная тРНК (initiator tRNA) всегда несет аминокислоту метионин (у бактерий используется модифицированная форма метионина — формилметионин), так что в итоге у всех недавно синтезированных белков N-конец — конец белка, который синтезируется первым, — начинается с метионина. Позже этот первый метионин обычно удаляется специальной протеазой. Факторы инициации могут специфически узнавать инициаторную тРНК, потому что она имеет последовательность нуклеотидов, отличающуюся от таковой

утРНК, которая переносит метионин в ходе элонгации.

Уэукариот комплекс инициаторная метионил-тРНК (Меt-тРНКи) сначала устанавливается на малую субчастицу рибосомы наряду с дополнительными бел-

ками, названными эукариотическими факторами инициации (eukaryotic initiation factors, eIFs) (рис. 6.72). Из всех имеющихся в клетке пар аминоацил–тРНК,

только нагруженная метионином инициаторная тРНК способна прочно связаться

смалой субчастицей рибосомы еще до образования цельной рибосомы — и она связывается непосредственно с P-сайтом. Затем малая субчастица рибосомы связывается с 5′-концом молекулы мРНК, которая опознается по 5′-кэпу и двум связанным

сней факторам инициации eIF4E (который непосредственно связывается с кэпом) и eIF4G (см. рис. 6.40). После этого малая субчастица рибосомы продвигается вперед по молекуле мРНК (в направлении 5′ → 3′) в поисках первого кодона AUG. Вспомогательные факторы инициации, которые действуют подобно подпитываемым энергией гидролиза ATP хеликазам, облегчают продвижение рибосомы через вторичные структуры РНК. В 90 % молекул мРНК трансляция начинается на кодоне AUG, встретившимся малой субчастице первым. В этой точке факторы инициации диссоциируют, позволяя тем самым большой субчастице рибосомы присоединиться к комплексу и довершить сборку рибосомы. Инициаторная тРНК все еще связана

сP-сайтом и нисколько не претендует на свободный A-сайт. Так что синтез белка готов к запуску (см. рис. 6.72).

Нуклеотиды, находящиеся в непосредственной близости от стартового участка эукариотических мРНК, влияют на эффективность узнавания кодона AUG в ходе вышеописанного процесса сканирования. Если такой искомый участок сильно отличается от консенсусной последовательности (5′–ACCAUGG–3′), то сканирующие рибосомные субчастицы иногда могут игнорировать первый кодон AUG в мРНК и перескакивать с него на второй или третий AUG-кодон. Клетки часто используют это явление, известное как «сканирование с подтеканием» («leaky scanning»), для того, чтобы с одной и той же молекулы мРНК производить два и более белков, отличающихся своими N-концами. Благодаря этому с некоторых генов один и тот же белок может быть синтезирован в двух вариантах, например, с сигнальной последовательностью на N-конце или без нее, — так что в зависимости от наличия/отсутствия сигнального пептида полученный белок будет направлен в один из двух разных компартментов клетки.

Бактерии имеют иной механизм выбора стартового кодона. Молекулы мРНК бактерий не несут кэп на 5′-конце, с помощью которого они могли бы сигнализировать рибосоме, где следует начинать поиск отправной точки трансляции. Вместо

Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 585

этого каждая бактериальная мРНК содержит специфический сайт посадки рибосомы (известный также как последовательность Шайна – Дальгарно, названная так по имени открывших ее исследователей) — он расположен несколькими нуклеотидами выше кодона AUG, с которого должна начаться трансляция. Эта последовательность нуклеотидов, в консенсусной форме 5′–AGGAGGU–3′, образует пары оснований с 16S рРНК малой субчастицы рибосомы, чтобы должным образом разместить инициаторный кодон AUG на рибосоме. Набор факторов инициации трансляции «дирижирует» этими взаимодействиями, равно как и последующим водружением большой рибосомной субчастицы, что и завершает сборку рибосомы.4

В отличие от эукариотической, рибосома бактерий может, следовательно, легко собираться прямо на стартовых кодонах, которые лежат на протяжении всей молекулы мРНК, при условии, что сайт посадки рибосомы предшествует ему на расстоянии нескольких нуклеотидов. В результате молекулы мРНК бактерий часто являются полицистронными — то есть они кодируют несколько различных белков, каждый из которых транслируется с одной и той же молекулы мРНК (рис. 6.73). В отличие от своих бактериальных аналогов, мРНК эукариот, как правило, кодирует лишь один-единственный белок.

Рис.6.73.СтруктуратипичнойбактериальноймРНК.Вотличиеотэукариотическихрибосом,которым обычнонуженкэпна5'-конце,рибосомыпрокариотинициируюттрансляциюнарибосом-связывающих сайтах(последовательностяхШайна – Дальгарно),которыемогутбытьрасположеныгдеугоднонамоле- кулемРНК.ДаннаяособенностьрибосомпозволяетбактериямсинтезироватьсодноймолекулымРНК неодин,анесколькоразличныхбелков.

6.2.11.  Стоп-кодоны отмечают конец трансляции

О конце кодирующего белок сообщения говорит присутствие одного из трех стоп-кодонов (UAA, UAG или UGA) (см. рис. 6.50). Они не распознаются тРНК и не кодируют никакой аминокислоты, но, вместо этого, служат для рибосомы сигналом к остановке трансляции. С любой рибосомой, в А-участке которой находится стоп-кодон, связываются белки, известные под названием факторов терминации трансляции5, которые вынуждают рибосомальную пептидилтрансферазу катализировать присоединение к пептидил-тРНК молекулы воды вместо аминокислоты (рис. 6.74). Эта реакция высвобождает карбоксильный конец растущей полипептидной цепи от связи с молекулой тРНК, и так как только эта связь обычно удерживает растущий полипептид в рибосоме, завершенная белковая цепь незамедлительно выскальзывает в цитоплазму. После этого рибосома освобождается от мРНК и диссоциирует на большую и малую субчастицы, которые могут собраться на этой или

4 Многие группы бактерий, такие как цианобактерии и микобактерии, не имеют последовательности Шайна – Дальгарно и способ определения стартового кодона для них не известен. — Прим. ред.

5 Иногда их называют факторами высвобождения — от англ. release factors.— Прим. ред.