Volume1

Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 499

Консервативные сайт-специфические рекомбиназы бактерий также стали мощными инструментами в руках ученых в области клеточной биологии и биологии развития. Чтобы выяснить роль определенного гена и белка в сложных многоклеточных организмах, с помощью методов генной инженерии получают мышей, несущих ген, кодирующий фермент сайт-специфической рекомбинации плюс тщательно разработанную конструкцию ДНК-мишени с участками, специфически узнаваемыми этим ферментом. В нужный момент времени ген, кодирующий этот фермент, можно активировать и тем самым перестроить последовательность ДНК мишени. Такие перестройки широко используются для делетирования (удаления) заданного гена в определенной ткани мыши (рис. 5.79). Эта методология особенно полезна в тех случаях, когда интересующий ген играет определяющую роль на ранних стадиях развития многих тканей и его полное удаление из зародышевой линии вызвало бы смерть в самом

Рис.5.79.Каксинтезируемыйбактериейферментконсервативнойсайт-специфическойрекомбинации можетбытьиспользовандляудалениязаданныхгеновизопределенныхтканеймыши.Этотподход требуетвстраиваниядвухспециальносконструированныхмолекулДНКвзародышевуюлиниюживотного. Перваясодержитгенрекомбиназы(вданномслучаерекомбиназаCreбактериофагаP1)подконтролем тканеспецифического промотора, что гарантирует экспрессию этой рекомбиназы только в этой ткани. Вторая молекула ДНК содержит интересующий нас ген, фланкированный участками (в данном случае участкамиloxP),узнаваемымиданнойрекомбиназой.Мышьпроектируетсятакимобразом,чтобыунее была единственная копия этого гена. Поэтому если рекомбиназа экспрессируется только в печени, то, значит,интересующийнасгенбудетудалентамитолькотам.

Какбудетописановглаве7,известномноготканеспецифическихпромоторов;болеетого,многиеизэтих промоторовактивнытольковопределенныемоментыразвитияорганизма.Такимобразом,возможно изучатьпоследствияделетированияопределенныхгеновнаразныхстадияхразвитиякаждойткани.

500 Часть 2. Основные генетические механизмы

начале эмбриогенеза. Та же стратегия может быть использована также и при неадекватной экспрессии любого заданного гена в интересующей ткани; в данном случае целенаправленная делеция позволит присоединить сильный промотор транскрипции к интересующему гену. Имея такой инструмент под рукой, можно, в принципе, определить действие любого белка в любой ткани организма животного.

Заключение

Геномы почти всех организмов содержат мобильные генетические элемен- ты, которые могут передвигаться из одной позиции генома в другую путем либо транспозиции, либо консервативной сайт-специфической рекомбинации.

В большинстве случаев такое перемещение носит случайный характер и про- исходит с очень низкой частотой. К мобильным генетическим элементам от- носят транспозоны, которые передвигаются в пределах одной клетки (и ее потомков), плюс те вирусы, геномы которых могут встраиваться в геномы клеток-хозяев.

Известно три класса транспозонов: ДНК-транспозоны, ретровирусподобные ретротранспозоны и неретровирусные ретротранспозоны. Все они, кроме последних, имеют близких родственников среди вирусов. Хотя вирусы и транспонируемые элементы можно рассматривать как клеточных паразитов, многие из новых последовательностей ДНК, которые были созданы событиями сайт-специфической рекомбинации, порождали генетическую изменчивость, необходимую для эволюции клеток и организмов.

Задачи

Какие утверждения являются верными? Обоснуйте свой ответ

5.1.В вашем теле нет двух клеток с идентичной нуклеотидной последователь-

ностью.

5.2.У E. coli, репликационная вилка которой перемещается со скоростью 500 п. н. в секунду, ДНК перед вилкой должна вращаться со скоростью почти 3 000 оборотов в минуту.

5.3.Когда двунаправленные репликационные вилки от смежных точек начала репликации встречаются, ведущая цепь всегда сталкивается с отстающей цепью.

5.4.Все механизмы репарации ДНК основаны на наличии в клетке двух копий генетической информации — по одной в каждой из двух гомологичных хромосом.

Обсудите следующие проблемы

5.5. Чтобы определить воспроизводимость результатов измерений частоты мутаций, вы проводите следующий эксперимент. Вы засеваете 10 культур однойединственной бактерией E. coli и позволяете культурам расти, пока каждая не будет содержать 106 клеток, а затем измеряете в каждой культуре число клеток, которые несут мутацию в интересующем вас гене. Вас настолько удивили предварительные результаты, что вы повторили эксперимент, дабы их подтвердить. Оба набора результатов дают картину чрезвычайно высокой изменчивости, как показано в таблице Q5.1. При том что мы полагаем частоту мутаций постоянной, по какой причине, согласно вашим предположениям, имеет место столь разительное различие значений частоты встречаемости мутантных клеток в разных культурах?

502 Часть 2. Основные генетические механизмы

Рис.Q5.2.Расщепленныйдуплекссоднонитевымихвостами,готовыми внедриться в неповрежденный гомологичный дуплекс (к за-

даче5.11).

5.10.С возрастом соматические клетки, как думают, накапливают геномные «шрамы» в результате неточной репарации двухцепочечных разрывов путем негомологичного соединения концов (NHE). Оценки, основанные на частоте разрывов

впервичных фибробластах человека, предполагают, что к 70-летнему возрасту каждая соматическая клетка человека может нести около 2 000 обусловленных NHE мутаций из-за неточностей в ходе репарации. Если бы эти мутации были распределены случайным образом по всему геному, то сколько генов, по вашему мнению, было бы повреждено? Считаете ли вы, что в таком случае функция клетки будет подорвана? Почему? (Предположите, что жизненно важную информацию несут 2 % генома: 1,5 % кодирующего и 0,5 % регуляторного.)

5.11.Нарисуйте двойную структуру Холлидея, которая образовалась бы в результате инвазии обоих концов разрушенного дуплекса в неповрежденный гомологичный дуплекс, показанный на рис. Q5.2. Пометьте левый конец каждой цепи

вструктуре Холлидея знаком 5′ или 3′, с тем чтобы их связи с родительским и рекомбинантным дуплексами были ясны. Укажите, как использовался бы синтез ДНК для заполнения одноцепочечных брешей в вашей двойной структуре Холлидея.

5.12.Почему случается так, что рекомбинация между подобными, но нетождественными повторами создает проблему клеткам человека? Как система устранения ошибок спаривания защищает нас от таких событий рекомбинации?

Литература

Общая

Biological Response to DNA Damage (2000) Cold Spring Harb. Symp. Quant.

Biol. 65.

Brown T. A. (2002) Genomes 2, 2nd ed. New York: Wiley-Liss.

Friedberg E. C., Walker G. C., Siede W. et al. (2005) DNA Repair and Mutagenesis. Washington, DC: ASM Press.

Hartwell L., Hood L., Goldberg M. L. et al. (2006) Genetics: from Genes to Genomes. Boston: McGraw Hill.

Stent G. S. (1971) Molecular Genetics: An Introductory Narrative. San Francisco: WH Freeman.

Watson J., Baker T., Bell S. et al. (2004) Molecular Biology of the Gene, 5th ed. Plainview, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Сохранение последовательностей ДНК в ходе эволюции

Cooper G. M., Brudno M., Stone E. S. et al. (2004) Characterization of evolutionary rates and constraints in three mammalian genomes. Genome Res. 14: 539–548.

Crow J. F. (2000) The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation. Nature Rev. Genet. 1: 40–47.

Hedges S. B. (2002) The origin and evolution of model organisms. Nature Rev. Genet. 3: 838–849.

King M. C., Wilson A. C. (1965) Evolution at two levels in humans and chimpanzees. Science 188: 107–16.

Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 503

Механизмы репликации ДНК

Alberts B (1998) The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell 92: 291–294.

Dillingham M. S. (2006) Replicative helicases: a staircase with a twist. Curr. Biol. 16: R844–R847.

Indiani C. & O’Donnell M. (2006) The replication clamp-loading machine at work in the three domains of life. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 7: 751–761.

Kornberg A. (1960) Biological synthesis of DNA. Science 131: 1503–1508.

Li J. J. & Kelly T. J. (1984) SV40 DNA replication in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6973.

Meselson M. & Stahl F. W. (1958) The replication of DNA in E. coli. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 44: 671–682.

Modrich P. & Lahue R. (1996) Mismatch repair in replication fidelity, genetic recombination, and cancer biology. Annu. Rev. Biochem. 65: 101–133.

Mott M. L. & Berger J. M. (2007) DNA replication initiation: mechanisms and regulation in bacteria. Nature Rev. Microbiol. 5: 343–354.

O’Donnell M. (2006) Replisome architecture and dynamics in E. coli. J. Biol. Chem. 281: 10653–10656.

Okazaki R., Okazaki T., Sakabe K. et al. (1968) Mechanism of DNA chain growth. I. Possible discontinuity and unusual secondary structure of newly synthesized chains.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 59: 598–605.

Raghuraman M. K., Winzeler E. A., Collingwood D. et al. (2001) Replication dynamics of the yeast genome. Science 294: 115–121.

Rao P. N. & Johnson R. T. (1970) Mammalian cell fusion: studies on the regulation of DNA synthesis and mitosis. Nature 225: 159.

Wang J. C. (2002) Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective.

Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3: 430–440.

Инициация и завершение репликации ДНК в хромосомах

Chan S. R. & Blackburn E. H. (2004) Telomeres and telomerase. Philos. Trans.

R Soc. Lond. B Bio. Sci. 359: 109–121.

Costa S. & Blow J. J. (2007) The elusive determinants of replication origins. EMBO Rep. 8: 332–334.

Groth A., Rocha W. & Almouzni G. (2007) Chromatin challenges during DNA replication and repair. Cell 128: 721–733.

Machida Y. J., Hamlin J. L. & Dutta A. (2005) Right place, right time, and only once: replication initiation in metazoans. Cell 123: 13–24.

O’Donnell M. & Kuriyan J. (2005) Clamp loaders and replication initiation.

Curr. Opin. Struct. Biol. 16: 35–41.

Robinson N. P. & Bell S. D. (2005) Origins of DNA replication in the three domains of life. FEBS J. 272: 3757–3766.

Smogorzewska A. & de Lange T. (2004) Regulation of telomerase by telomeric proteins. Annu. Rev. Biochem. 73: 177–208.

Репарация ДНК

Barnes D. E., & Lindahl T. (2004) Repair and genetic consequences of endogenous DNA base damage in mammalian cells. Annu. Rev. Genet. 38: 445–476.

Harrison J. C. & Haber J. E. (2006) Surviving the breakup: the DNA damage checkpoint. Annu. Rev. Genet. 40: 209–235.

504 Часть 2. Основные генетические механизмы

Heller R. C. & Marians K. J. (2006) Replisome assembly and the direct restart of stalled replication. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 7: 932–43.

Lieber M., Ma Y. et al. (2003) Mechanism and regulation of human nonhomologous­ DNA end-joining. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 4: 712–720.

Lindahl T. (1993) Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature

362:709–715.

Prakash S. & Prakash L. (2002) Translesion DNA synthesis in eukaryotes: a one-

or two-polymerase affair. Genes. Dev. 16: 1872–1883.

Sancar A., Lindsey-Boltz L. A. et al. (2004) Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Annu. Rev. Biochem. 73: 39–85.

Svejstrup J. Q. (2002) Mechanisms of transcription-coupled DNA repair. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3: 21–29.

Wyman C. & Kanaar R. (2006) DNA double-strand break repair: all’s well that ends well. Annu Rev. Genet. 40: 363–383.

Гомологичная рекомбинация

Adams M. D., McVey M. & Sekelsky J. J. (2003) Drosophila BLM in doublestrand break repair by synthesis-dependent strand annealing. Science 299:265–267.

Cox M. M. (2001) Historical overview: searching for replication help in all of the rec places. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 8173–8180.

Holliday R. (1990) The history of the DNA heteroduplex. BioEssays 12: 133–

142.

Lisby M., Bartow J. H. et al. (2004) Choreography of the DNA damage response: spatiotemporal relationships among checkpoint and repair proteins. Cell 118: 699–713.

McEachem M. J. & Haber J. E. (2006) Break-induced replication and recombinational telomere elongation in yeast. Annu. Rev. Biochem. 75: 111–135.

Michel B., Gromponee G. et al. (2004) Multiple pathways process stalled replication forks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 12783–12788.

Szostak J. W., Orr-Weaver T. K., Rothstein R. J. et al. (1983) The double-strand break repair model for recombination. Cell 33: 25–35.

West S. C. (2003) Molecular views of recombination proteins and their control.

Nature Rev. Mol. Cell Biol. 4: 435–445.

Транспозиция и сайт-специфическая рекомбинация

Campbell A. M. (1993) Thirty years ago in genetics: prophage insertion into bacterial chromosomes. Genetics 133: 433–438.

Comfort N. C. (2001) From controlling elements to transposons: Barbara McClintock and the Nobel Prize. Trends Biochem. Sci. 26: 454–457.

Craig N. L. (1996) Transposition, in Escherichia coli and Salmonella, pp. 2339–2362. Washington, DC: ASM Press.

Gottesman M. (1999) Bacteriophage lambda: the untold story. J. Mol. Biol. 293: 177–180.

Grindley N. D., Whiteson K. L. & Rice P. A. (2006) Mechanisms of site-specific recombination. Annu. Rev. Biochem. 75: 567–605.

Varmus H. (1988) Retroviruses. Science 240: 1427–1435.

Zickler D. & Kleckner N. (1999) Meiotic chromosomes: integrating structure and function. Annu. Rev. Genet. 33: 603–754.

Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 507

Разумно было бы предположить, что хранящаяся в геномах информация устроена упорядоченным образом — наподобие словаря или телефонной книги. Однако, хотя геномы некоторых бактерий и кажутся вполне сносно организованными, геномы большинства многоклеточных организмов, хотя бы у представленной нами в качестве примера дрозофилы, на удивление неупорядоченны. Маленькие крупицы кодирующей ДНК (то есть ДНК, которая кодирует белки) перемежаются протяженными массивами, по-видимому, «бессмысленной» ДНК. Некоторые участки генома несут много генов, а другие совершенно их не содержат. Белки, которые в клетке работают в тесной связи друг с другом, часто кодируются генами, расположенными на разных хромосомах, а соседствующие гены обычно кодируют белки, которые имеют мало общего друг с другом. Поэтому расшифровка геномов отнюдь не простое дело. Даже при помощи мощных компьютеров исследователям все еще сложно окончательно определить местонахождение начала и конца гена в последовательностях ДНК сложных геномов, а тем более предсказать для каждого гена время его экспрессии в течение жизни данного организма. Хотя последовательность ДНК генома человека известна, вероятно, потребуется по крайней мере десятилетие, чтобы идентифицировать все гены и определить точные аминокислотные последовательности белков, производимых с их помощью. А клетки в нашем организме делают все это по тысяче раз в секунду!

Геномная ДНК не управляет синтезом белка «самолично», а использует для этого РНК в качестве посредника. Когда у клетки возникает надобность в некотором белке, последовательность нуклеотидов соответствующей части безмерно длинной молекулы ДНК в хромосоме сначала копируется в РНК (этот процесс называется транскрипцией). Именно эти РНК-копии фрагментов ДНК и служат непосредственными матрицами, направляющими синтез белка (процесс, названный трансляцией). Поэтому поток генетической информации в клетках направлен от ДНК к РНК и далее — к белку (рис. 6.2). Клетки всех живых организмов — от бактерий до человека — экспрессируют свою генетическую информацию таким образом; и этот фундаментальный принцип назван центральной догмой молекулярной биологии.

Несмотря на универсальность центральной догмы, на пути, по которому информация перетекает из ДНК в белки, встречаются разные «развязки». На главной из них в клетках эукариот РНК-транскрипты, прежде чем им будет дозволено выйти из ядра и претерпеть трансляцию в белок, подвергаются серии «обрабатывающих» операций (процессингу), в число которых входит и сплайсинг РНК. Такой поэтапный процессинг может коренным образом изменить «смысл» молекулы РНК и поэтому крайне важен для понимания механизма считывания геномов в клетках эукариот. Наконец, хотя в этой главе мы сосредоточили внимание на продуцировании белков,

нальначислуизвестныхкДНК,которыесоответствуютэтомугену.(Какбудетописановглаве8,молекулы кДНК суть ДНК-копии молекул мРНК, и большие коллекции нуклеотидных последовательностей кДНК размещенывразличныхбазахданных;чембольшесовпадениймеждуихпоследовательностями,тем выше достоверность того, что предсказанный ген транскрибируется в РНК и является, таким образом, подлиннымгеном.)Цветкаждогоприписанногоксвоемугенупрямоугольникауказывает,известенли близкородственный ген у других организмов. Например, MWY (Mammals-Worms-Yeast) означает, что данный ген имеет близких родственников у млекопитающих, у червя нематоды Caenorhabditis elegans иудрожжейSaccharomycescerevisiae.MWуказывает,чтоэтотгенимеетблизкихродственниковумлеко- питающихичервя,нонеудрожжей.РадужнаяполосапоказываетдолюпароснованийG–C;вомногих различных геномах эта величина поразительно отличается для различных областей генома; происхождениеизначениетакойвариабельностипоканеясны.(ИзображениезаимствованоизM. D. Adams etal.,Science287:2185–2195,2000.СлюбезногоразрешенияиздательстваAAAS.)