538 Часть 2. Основные генетические механизмы
протекания реакции сплайсинга новые компоненты входят в нее, в то время как те, что уже выполнили свои задачи, «выбрасываются за борт» (рис. 6.29). Однако многие ученые полагают, что сплайсосома — это присущая клетке «рыхлая» сборка всех компонентов, — захватывающая, сращивающая и высвобождающая РНК как согласованная единица, которая претерпевает серьезные перестройки в каждом событии сплайсинга. В ходе реакции сплайсинга распознавание 5′ границы сплайсинга, участка точки разветвления и 3′-границы сплайсинга выполняется, в значительной степени, за счет спаривания оснований между молекулами snРНК и консенсусными последовательностями в субстрате — пре-мРНК (рис. 6.30). В ходе
Рис.6.29.Механизмсплайсингапре-мРНК.СплайсингРНКкатализируетсякомплексомsnРНП(изображен в виде цветных кругов) вместе с другими белками (большинство из которых не показано) — все они, вместе взятые, и составляют сплайсосому. Сплайсосома распознает сигналы сплайсинга на молекуле пре-мРНК,сводитобаконцаинтронадругсдругомиобеспечиваетферментативнуюактивностьнадвух этапахреакции(см.рис.6.26).
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 539
Рис. 6.30. Некоторые перестройки, которые происходят в сплайсосоме при сплайсинге пре-мРНК.
На этой схеме представлены любопытные моменты работы сплайсосомы дрожжей Saccharomyces cerevisiae,укоторойвовлеченныевсплайсингпоследовательностинуклеотидовнесколькоотличаются от таковых в клетках человека. а) Обмен U1 snРНП на U6 snРНП происходит перед первой реакцией переносафосфорильнойгруппы(см.рис.6.29).Длятакогообменатребуется,чтобы5'-сайтсплайсинга был считан двумя разными snРНП, что тем самым повышает точность выбора сплайсосомой 5'-сайта сплайсинга. б) Сайт точки ветвления сначала узнается BBP, а затем U2 snРНП; как в случае а, такая стратегия «проверки и перепроверки» обеспечивает повышенную точность выбора сайта сплайсинга. Связывание U2 с точкой разветвления вынуждает соответствующий неспаренный аденин (красный) выйти из спаренной области и таким образом активирует его для реакции с 5'-сайтом сплайсинга (см. рис.6.29).Это,всочетаниисузнаваниемприпомощиBBP,иестьтотпуть,которымсплайсосоматочно выбирает аденин, который должен в конечном счете сформировать точку разветвления. в) После того какперваяреакцияпереносафосфорильнойгруппы(слева)произошла,рядперестроексводитэтидва экзона вместе — для второй реакции переноса фосфорила (справа). Молекулы snРНК и размещают «реагенты»должнымобразом,иобеспечиваютих(иливсе,иличасть)каталитическиимисайтамидля осуществленияэтихдвухреакций.U5snРНПприсутствуетвсплайсосомедотогомомента,какэтаперестройка произойдет; для простоты она была изъята из левой модели структуры. Как сказано в тексте, все перегруппировки РНК–РНК, показанные на этом рисунке (равно как и другие, которые происходят всплайсосоме,нонепоказаны),требуютучастиядополнительныхбелковигидролизаATP.
реакции сплайсинга сплайсосома подвергается нескольким сдвигам, при которых один набор комплементарных взаимодействий оснований разрывается, а другой образуется на его месте. Например, U1 замещается на U6 на 5′-границе сплайсинга (см. рис. 6.30, а). Такого типа перестройки РНК–РНК (при которых образование
540 Часть 2. Основные генетические механизмы
одного РНК-РНК взаимодействия требует разрыва другого) происходят несколько раз в ходе реакции сплайсинга. Это обеспечивает проверку и перепроверку последовательностей РНК прежде, чем произойдет химическая реакция, — и таким образом повышается точность сплайсинга.
6.1.15. Для выполнения сложного ряда РНК-РНК перегруппировок сплайсосома использует гидролиз ATP
Хотя гидролиз ATP не требуется для химии РНК-сплайсинга per se, он необходим для сборки и перестроек сплайсосомы. Некоторые из вспомогательных белков, которые составляют сплайсосому, используют энергию гидролиза ATP для разрыва существующих взаимодействий РНК–РНК, чтобы на их «обломках» могли образоваться новые. Фактически, все этапы, показанные ранее на рис. 6.29, — кроме посадки BBP на участок точки разветвления и U1 snРНП на 5′-сайт сплайсинга, — требуют гидролиза ATP и участия дополнительных белков. Для успешного протекания одного события сплайсинга необходимо участие не менее 200 белков, если учесть и те, что образуют snРНП.
Нуждающиеся в гидролизе ATP перегруппировки РНК–РНК, которые имеют место в сплайсосоме, происходят как в самих snРНП, так и между snРНП и субстратом пре-мРНК. Одна из наиболее важных функций таких перестроек — обустройство активного каталитического участка сплайсосомы. Стратегия создания активного участка только после сборки и перестройки участвующих в сплайсинге компонентов на субстрате пре-мРНК представляет собой эффективный способ предотвращения неправильного сплайсинга.
Возможно, самая удивительная особенность сплайсосомы — природа самого каталитического участка: он в основном (если не исключительно) сформирован молекулами РНК, а не белков. В последнем параграфе этой главы мы в общих чертах обсуждаем структурные и химические свойства РНК, которые позволяют ей выполнять катализ; здесь нам будет достаточно лишь упомянуть, что U2 и U6 snРНК в сплайсосоме формируют точную трехмерную структуру РНК, которая совмещает 5′-сайт сплайсинга в пре-мРНК с сайтом точки разветвления и, вероятно, выполняет первую реакцию трансэтерификации (см. рис. 6.30, в). Подобным же образом 5′- и 3′-границы сплайсинга сводятся воедино (событие, требующее участия U5 snРНК), с тем чтобы облегчить вторую реакцию трансэтерификации.
По завершении химической части сплайсинга, snРНП остаются связанными с «лассо». Выпутывание этих snРНП из «лассо» (и отделение их друг от друга) зависит от следующего цикла РНК–РНК перестроек, для чего необходим гидролиз ATP, — в результате snРНК возвращаются к своей первоначальной конфигурации, так что они снова могут быть вовлечены в новый цикл реакций. При завершении процесса сплайсосома направляет набор белков для связывания их с мРНК вблизи позиции, прежде занимаемой интроном. Названные в совокупности комплексом соединения экзонов (EJC; exon junction complex), эти белки отмечают участок успешно прошедшего события сплайсинга и, как мы увидим позже в этой главе, влияют на последующую судьбу этой мРНК.
6.1.16. Некоторые особенности пре-мРНК и ее синтеза помогают объяснить принципы выбора истинных сайтов сплайсинга
Как мы увидели, последовательности интронов сильно разнятся по размерам, а некоторые составляют даже более 100 000 нуклеотидов. Если бы выбор участка
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 541
сплайсинга определялся исключительно snРНП, работающими на первичной, свободной от белков молекуле РНК, то следовало бы ожидать, что ошибки — такие как пропуск экзона и использование «скрытых» сайтов сплайсинга, — будут возникать очень часто (рис. 6.31). Однако встроенные в сплайсосомы механизмы «обеспечения качества» укомплектованы двумя дополнительными системами, которые увеличивают точность сплайсинга. Первая есть просто следствие ранних стадий сплайсинга, происходящих, когда молекулы пре-мРНК синтезируются РНК-полимеразой II. В ходе транскрипции фосфорилированный хвост РНК-полимеразы несет несколько компонентов сплайсосомы (см. рис. 6.23), и эти компоненты переносятся непосредственно с полимеразы на РНК по мере ее синтеза. Эта стратегия помогает клетке отслеживать интроны и экзоны: например, snРНП, которые собираются на 5′-сайте сплайсинга, изначально встречаются только с одним 3′-сайтом сплайсинга, так как участки, расположенные ниже, еще не синтезированы к тому времени. Транскрипция, согласованная со сплайсингом, особенно важна для предотвращения пропуска истинных экзонов.
Рис.6.31.Дватипаошибоксплайсинга.а)Пропускэкзона.б)Выборскрытогосайтасплайсинга.Скрытые сигналысплайсинга—нуклеотидныепоследовательностиРНК,которыеблизконапоминаютистинные сигналысплайсинга.
Стратегия, названная определением экзона (exon definition), представляет собой другой способ, которым клетки выбирают правильные сайты сплайсинга. Размер экзонов, как правило, является намного более постоянным, чем размер интронов, и, несмотря на широкое разнообразие организмов эукариот, составляет в среднем около 150 пар нуклеотидов (рис. 6.32). Согласно представлению об определении экзона сплайсинг-выполняющая машина первоначально отыскивает относительно одинаковые по размеру последовательности экзонов. По мере синтеза РНК группа дополнительных компонентов (в особенности белки SR, названные так потому, что они содержат домен, обогащенный серином и аргинином) собирается на последовательностях экзонов и помогает «отметить» каждый 3′- и 5′-сайт сплайсинга, начиная с 5′-конца РНК (рис. 6.33). Эти белки, в свою очередь, привлекают к участию U1 snРНК, которая отмечает нижележащую границу экзона, и U2AF, который определяет вышележащую границу. Специфически маркируя экзоны таким способом и при этом извлекая выгоду из относительно однородного размера экзонов, клетка увеличивает точность, с которой она размещает первичные компоненты сплайсинга на синтезируемой РНК, и тем самым избегает сплайсинга скрытых сайтов. Каким образом белки SR отличают последовательности экзонов от последовательностей интронов, до конца еще не понятно; однако известно, что некоторые из SR белков связываются предпочтительно с определенными последовательностями экзонов, названными усилителями, или энхансерами, сплайсинга (splicing enhancers). В принципе, так как для кодирования данной
542 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.6.32.Колебаниядлиныинтроновиэкзоноввгеномахчеловека,червяимухи.а)Распределение размеров экзонов. б) Распределение размеров интронов. Обратите внимание, что длина экзонов намногоболееоднородна,чемдлинаинтронов.(ПереработанонаосноведанныхизInternationalHuman Genome Sequencing Consortium, Nature 409: 860–921, 2001. С любезного разрешения издательства MacmillanPublishersLtd.)
аминокислоты может быть использован любой из соответствующих ей кодонов, есть свобода выбора при формировании нуклеотидной последовательности экзона, что позволяет обеспечить участок связывания белка SR, не затрагивая при этом последовательности аминокислот, кодируемой этим экзоном.
Как маркировка границ экзонов и интронов, так и сборка сплайсосомы начинается на молекуле РНК — когда РНК-полимераза все еще элонгирует 3′-конец РНК. Однако химическая часть сплайсинга в действительности может происходить намного позже. Такая задержка означает, что последовательности интронов не обязательно удаляются из молекулы пре-мРНК в том порядке, в котором они расположены в цепи РНК. Это означает также и то, что, хотя сборка сплайсосомы сопутствует процессу транскрипции, реакции сплайсинга иногда происходят посттранскрипционно — то есть после того как молекула пре-мРНК полностью готова.
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 543
Рис. 6.33. Концепция определения экзона. Согласно одному предположению, SR-белки связываются с каждой последовательностью экзона в пре-мРНК и таким образом помогают направлять молекулы snРНПкистинныминтрон-экзоннымграницам.ТакоеразграничиваниеэкзоновSR-белкамипроисходит котранскрипционно,начинаясCBC(комплекспосадкинакэп)на5'-конце.Какпоказанонарисунке,впре- мРНКпоследовательностиинтронов,аонимогутбытьчрезвычайнодлинными,упакованывкомплексы hnРНП (гетерогенного ядерного рибонуклеопротеида), которые уплотняют их в более удобные для манипуляций структуры и, возможно, маскируют скрытые сайты сплайсинга. Предполагают, что белки hnРНП предпочтительно связываются с последовательностями интронов и это помогает сплайсосоме отличатьинтроныотэкзонов.Однако,какпоказанонасхеме,покрайнеймеренекоторыебелкиhnРНП связываютсятакжеиспоследовательностямиэкзонов.(ПереработаноизR. Reed,Curr.Opin.CellBiol.12: 340–345,2000.СблагосклонногоразрешенияиздательстваElsevier.)
6.1.17. Второй набор snРНП сплайсирует минорную фракцию последовательностей интронов у животных и растений
Простые эукариоты, такие как дрожжи, имеют только один набор snРНП, которые выполняют весь сплайсинг пре-мРНК. Однако более сложные эукариоты типа мух, млекопитающих и растений имеют второй набор молекул snРНП, которые направляют сплайсинг интронных последовательностей. Эта минорная форма сплайсосомы распознает иной набор последовательностей РНК на 5′- и 3′-границах сплайсинга и в точке ветвления; ее называют сплайсосомой U12 типа (U12-type spliceosome) ввиду причастности к ней U12 snРНП (рис. 6.34, а). Несмотря на узнавание иных нуклеотидных последовательностей, snРНП в этой сплайсосоме налаживают те же виды взаимодействий типа РНК–РНК с пре-мРНК и друг другом, что и основные snРНП (рис. 6.34, б). Хотя, как мы убедились, компоненты большинства сплайсосом перемещаются вместе с РНК-полимеразой II, когда она транскрибирует гены, это может быть и не так для сплайсосомы U12. Возможно, что опосредствованный U12 сплайсинг таким образом задерживается во времени и это дает клетке возможность сорегулировать сплайсинг нескольких сотен генов, экспрессия которых невозможна без привлечения этой сплайсосомы. Ряд молекул мРНК млекопитающих содержит смесь интронов, некоторые удаляются основной сплайсосомой, а другие — минорной сплайсосомой, и было высказано предположение о том, что такой принцип позволяет осуществлять альтернативный сплайсинг по особо сложным схемам.
544 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.6.34.Общаясхемамеханизмов,используемыхвтрехтипахРНК-сплайсинга.а)Сплайсосомытрех типов.Основнаясплайсосома(слева),сплайсосоматипаU12(посередине)итранс-сплайсосома(справа) показанывдвухстадияхсборки.Интроны,удаляемыесплайсосомойтипаU12,имеютинойнаборконсенсусныхпоследовательностейнуклеотидов,чемудаляемыеосновнойсплайсосомой.Учеловека,согласно оценкам,0,1 %интроновудаляетсясплайсосомойтипаU12.Притранс-сплайсинге,которыйучеловека непроисходит,реакцииподвергаетсяSLsnРНП,потомучточастьSLsnРНКстановитсяпервымэкзоном зрелоймРНК.б)ИмажорныйU6snРНП,иU6snРНП,специфичныйдлясплайсосомыU12 типа,узнают 5'-границу сплайсинга, но делают это, используя разные наборы взаимодействующих пар оснований. Нарисункепредставленыпоследовательностиизгеномачеловека.(ПереработанонаосновеY. T. Yuetal., TheRNAWorld,pp.487–524.ColdSpringHarbor,NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1999.)
У нескольких представителей эукариот выявлена особенная разновидность сплайсинга, получившая название транс-сплайсинга (trans-splicing). К таким организмам относятся одноклеточные трипаносомы — простейшие животные, которые вызывают у людей африканскую сонную болезнь, — и используемый как экспериментальная модель многоклеточный организм — червь нематода. При транссплайсинге экзоны из двух разных РНК-транскриптов соединяются друг с другом
иобразуют молекулу зрелой мРНК (см. рис. 6.34, а). Трипаносомы производят все свои молекулы мРНК этим способом, тогда как у нематоды транс-сплайсинг отвечает лишь примерно за 1 % молекул мРНК. В обоих случаях один и тот же экзон сращивается с 5′-концом многих разных РНК-транскриптов, произведенных клеткой; таким образом, все продукты транс-сплайинга имеют один и тот же 5′-экзон
иразные 3′-экзоны. Многие из тех же видов молекул snРНП, работающих на поприще обычного сплайсинга, задействованы в этой реакции, хотя транс-сплайсинг
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 545
использует уникальный snРНП (названный SL, spliced leader, РНП), который и вносит в транскрипты общий экзон (см. рис. 6.34).
Мы даже не представляем, для чего эти организмы используют транс-сплайсинг; однако можно предположить, что общий 5′-экзон может помогать при трансляции мРНК. Так, молекулы мРНК, произведенные в ходе транс-сплайсинга нематод, видимо, транслируются очень интенсивно.
6.1.18. РНК-сплайсинг удивительно пластичен
Мы увидели, что выбор участков сплайсинга зависит от таких особенностей транскрипта пре-мРНК, как сродство «машины» сплайсинга к трем сигналам на РНК (5′- и 3′-границам сплайсинга и точке ветвления), котранскрипционная сборка сплайсосомы и «бухгалтерия», лежащая в основе определения экзона. Мы не знаем, насколько точно происходит сплайсинг в норме, потому что, как увидим позже, существует несколько систем контроля его «качества», которые быстро уничтожают молекулы мРНК, сращивание которых идет неправильно. Однако нам известно, что по сравнению с другими этапами экспрессии гена сплайсинг необычайно пластичен. Например, мутация в последовательности нуклеотидов, критически важной для вырезания какого-либо конкретного интрона, не обязательно препятствует вырезанию этого интрона бесповоротно. Вместо этого мутация обычно порождает новую схему сплайсинга (рис. 6.35). Чаще всего экзон попросту пропускается (рис. 6.35, б).
Рис. 6.35. Неправильный процессинг первичного РНК-транскрипта β-глобина у людей, страдающих
β-талассемией.Впредставленныхпримерахзаболеваниевызваномутациямивучасткахсплайсинга(черные стрелки).Темно-синиеполоскиобозначаюттринормальныепоследовательностиэкзонов;красныелинии отмечают5'-и3'-границысплайсинга.Голубыеполоскиотображаютновыепоследовательностинуклеоти- дов,включенныевконечнуюмолекулумРНКврезультатемутации.Обратитевнимание,чтокогдамутация занимаетнормальныйучастоксплайсинга,оставив,такимобразом,другойучастоксплайсингабезпартнера, тоэкзонпропускается;либоодинилинесколькоблизлежащихскрытыхучастковсплайсингаиспользуются в качестве участка-партнера, как на схемах ви г. (Переработано отчасти из S. H. Orkin, The Molecular Basis ofBloodDiseases[G. Stamatoyannopoulosetal.,eds.],pp.106–126.Philadelphia:Saunders,1987.)
546 Часть 2. Основные генетические механизмы
В других случаях мутация обусловливает эффективное использование скрытого сайта сплайсинга (рис. 6.35, в). Очевидно, сплайсирующие машины эволюционировали таким образом, чтобы выбирать наилучшую из возможных схем границ сплайсинга,
иесли оптимальная схема повреждена мутацией, то они будут искать следующую по оптимальности схему и так далее. Такая гибкость процесса сплайсинга РНК предполагает, что изменения в профилях сплайсинга, вызываемые случайными мутациями, были важной составляющей эволюции генов и организмов.
Пластичность сплайсинга РНК также означает, что клетка может регулировать схему РНК-сплайсинга. Ранее в этом параграфе мы говорили о том, что альтернативный сплайсинг может дать начало различным белкам, получаемым из одного и того же гена. Некоторые примеры альтернативного сплайсинга носят конститутивный характер — то есть альтернативно сплайсированные молекулы мРНК постоянно производятся клетками организма. Однако во многих случаях клетка регулирует схемы сплайсинга таким образом, что в разное время и в различных тканях производятся разные формы данного белка (см. рис. 6.27). В главе 7 мы вернемся к этому вопросу
иобсудим некоторые характерные примеры регулируемого РНК-сплайсинга.
6.1.19. Катализируемый сплайсосомой РНК-сплайсинг, вероятно, эволюционировал от механизмов самосплайсинга
Когда сплайсосома была открыта, она озадачила молекулярных биологов рядом вопросов. Почему молекулы РНК, а не белка, выполняют важную роль опознавания участков сплайсинга и составляют химическую основу самого процесса сплайсинга? Почему используется промежуточный продукт — лассо-подобная структура, а не очевидная более простая альтернатива: сведение 5′- и 3′-сайтов сплайсинга друг с другом за один шаг, за чем следовало бы их прямое расщепление и воссоединение? Ответы на эти вопросы описывают предполагаемый эволюционный путь, который прошла сплайсосома.
Как было вскользь упомянуто в главе 1 (и будет сказано подробнее в заключительном разделе этой главы), весьма вероятно, что на заре эволюции клетки использовали молекулы РНК, а не белков в качестве главных катализаторов и хранили они свою генетическую информацию в последовательностях РНК, а не ДНК. Катализируемые РНК реакции сплайсинга, возможно, играли важную роль в этих доисторических клетках. Живым свидетельством этого служат некоторые интроны самосплайсирующейся РНК (self-splicing RNA; то есть последовательности интронов в РНК, вырезание которых может происходить в отсутствие белков или любых других молекул РНК), встречающиеся, например, в генах ядерных рРНК ресничной инфузории Tetrahymena, в нескольких генах бактериофага T4 и в некоторых генах митохондрий и хлоропластов.
Самосплайсирующаяся последовательность интрона может быть идентифицирована в пробирке: при инкубации очищенной РНК, молекула которой содержит последовательность интрона, можно наблюдать реакцию сплайсинга. Подобным образом можно выделить два основных класса самосплайсирующихся последовательностей интронов. Последовательности интронов группы I начинают реакцию сплайсинга, связывая нуклеотид G с последовательностью интрона; этот G таким путем активируется с образованием группы, которая атакует и разрывает первую из фосфодиэфирных связей, расщепляемых в ходе сплайсинга (связь в 5′-сайте сплайсинга). В последовательностях интронов группы II особо реакционно-
способный остаток А выступает в роли атакующей группы, которая и индуцирует
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 547
образование промежуточной лассо-подобной структуры. Во всем остальном пути протекания реакций самосплайсинга для последовательностей интронов двух типов одинаковы. Оба, как предполагается, представляют собой «пережитки» очень древних механизмов (рис. 6.36).
Для реакций самосплайсинга этих двух типов нуклеотидная последовательность интрона имеет определяющее значение; РНК интрона сворачивается в определенную трехмерную структуру, в результате чего 5′- и 3′-границы сплайсинга сводятся вместе, обеспечивая тем самым точное расположение реакционно-способных групп
Рис.6.36.Дваизвестныхклассасамосплайсирующихсяпоследовательностейинтронов.Рисунокпод-
черкиваетподобиямеждуэтимидвумямеханизмами.Обаобычноприбегаюткпомощибелковклетки, которыеускоряютреакцию,нокатализтемнеменееопосредуетсяРНКвпоследовательностиинтрона. ПоследовательностиинтроновгруппыIсвязываютсвободныйнуклеотидGсоспецифическимучастком РНК—чтобыинициироватьсплайсинг;тогдакакпоследовательностиинтроновгруппыIIиспользуютдля тойжецелиотличающийсяособойреакционнойспособностьюнуклеотидА,находящийсявсамойпоследовательностиинтрона.Обатипареакцийсамосплайсингатребуют,чтобыинтроннаходилсявкрайне специфичнойтрехмернойструктуре,котораяобеспечиваетнеобходимоекаталитическоедействие(см. рис. 6.6). Механизм, используемый последовательностями интронов группы II, высвобождает интрон ввиделассо-подобнойструктурыиоченьнапоминаетпроцесссплайсингапре-мРНК,катализируемого сплайсосомой(сравнитесрис.6.29).ВклеткахэукариотосновнуюнагрузкувходеРНК-сплайсингавыпол- няетсплайсосома,асамосплайсирующиесяРНКпредставляютсобойнеобычныеслучаи.(Переработано наосновеT. R. Cech,Cell44:207–210,1986.СлюбезногоразрешенияиздательстваElsevier.)
