Volume1

528 Часть 2. Основные генетические механизмы

эукариот должны также преодолевать еще одно препятствие — структурированный хроматин; и им, как правило, содействуют ATP-зависимые комплексы перестройки хроматина (см. стр. 329–332). Такие комплексы могут двигаться вместе с полимеразой или могут просто «отыскивать и выручать» случайно застопоренную полимеразу. Вдобавок к этому некоторые факторы элонгации, связанные с РНК-полимеразой эукариот, облегчают транскрипцию через нуклеосомы, не требуя для этого дополнительной энергии. Еще не совсем понятно, как им этого удается, но такие белки могут кратковременно вытеснять димеры H2A-H2B из стержня нуклеосомы, замещая их, пока полимераза проходит через данную нуклеосому.

Есть еще одно препятствие для элонгирующих полимераз, как бактериальных, так и эукариотических. Перед тем как обсудить эту проблему, мы должны рассмотреть хитрое свойство, характерное для двойной спирали ДНК и назван-

ное суперспирализацией, или сверхспирализацией, ДНК (DNA supercoiling).

Суперспирализованная ДНК представляет собой конформацию, которую ДНК принимает в ответ на возникающее напряжение; в свою очередь, формирование различных петель или супервитков в дуплексе ДНК может создать такое напряжение. На рис. 6.20 представлены топологические аспекты сверхспирализации ДНК. На каждый виток двойной спирали ДНК приходится примерно 10 пар нуклеотидов. Представим спираль, оба конца которой закреплены друг относительно друга (как это имеет место в кольце ДНК, например, бактериальной хромосомы или в сильно затянутой петле, в каковой форме, как думают, она существует в хромосомах эукариот). В таком случае раскручивание каждых 10 пар нуклеотидов будет компенсироваться формированием одного большого супервитка ДНК. Формирование такой суперспирали энергетически благоприятно, потому что оно восстанавливает нормальный шаг двойной спирали в остальных областях со спаренными основаниями, которые иначе должны были бы сжаться из-за закрепленных концов.

РНК-полимераза также создает напряжение при движении по участку ДНК с закрепленными концами (см. рис. 6.20, в). Поскольку движущаяся полимераза не может быстро вращаться (и такое вращение затруднено в силу размера РНКполимераз и присоединенных к ним транскриптов), ее продвижение по ДНК вызывает положительное напряжение в спирали ДНК перед ферментом и отрицательное напряжение позади него. Эукариотам эта ситуация, как думают, дает определенное преимущество: положительная суперспирализация ДНК перед полимеразой затрудняет раскрытие спирали ДНК, но она же должна облегчать распаковывание ДНК в нуклеосомах, поскольку высвобождение ДНК из гистонового стержня помогает снять положительную суперспирализацию.

Любой белок, который продвигается по цепи ДНК в двойной спирали, как правило, создает в ней напряжение, что приводит к суперспирализации ДНК. У эукариот ферменты ДНК-топоизомеразы быстро это устраняют (см. разд. 5.2.10). В бактериях же специализированная топоизомераза, называемая ДНК-гиразой, используя энергию гидролиза ATP, непрерывно образует в ДНК супервитки, тем самым поддерживая постоянство напряжения в ДНК. Это отрицательные супервитки (отрицатель-

ная суперспираль) — они закручены в направлении противоположном тому, ко-

торое возникает в положительных супервитках (положительной суперспирали),

формирующихся при раскрытии (расплетании) любой области спирали ДНК (см. рис. 6.20, б). Всякий раз, когда в бактериальной ДНК расплетается какая-либо область спирали, отрицательная суперспирализация ДНК снимается. Следовательно, под действием ДНК-гиразы раскрытие спирали ДНК у бактерий будет энергетически

Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 531

У эукариот модифицируются оба конца молекул мРНК: 5′-конец кэпируется

(capping), а 3′-конец полиаденилируется (polyadenylation) (рис. 6.22). Такие

«специальные» концы позволяют клетке установить, присутствуют ли оба конца

Рис.6.22.СравнениеструктурымолекулмРНКпрокариотиэукариот.а)5'-

и 3'-концы бактериальной мРНК — немодифицированные концы цепи, синтезированныеРНК-полимеразой, которая соответственно начинает и завершает транскрипцию в этих точках. Соответствующие концы мРНК эукариот образуются кэпированием 5' и расщеплением транскрипта пре-мРНК с последующим присоединением поли(А)-хвоста. На рисунке показано также и другое различие между молекулами мРНК прокариотиэукариот:молекулыбактериальной мРНК могут содержать инструкции для нескольких разных белков, тогда как молекулы мРНК эукариот почти всегда содержат информацию только о каком-то одном белке. б) Кэп-структура на 5'-конце молекулы эукариотической мРНК. Обратите внимание на необычную 5'–5' связь 7-метилгуанина с остальной частью РНК. Многие молекулы мРНК эукариот несут дополнительную модификацию: метилирование 2'-гидроксильнойгруппырибозывто- рогонуклеотида(непоказано).

532 Часть 2. Основные генетические механизмы

на молекуле мРНК (и таким образом удостовериться в целостности записанной информации), прежде чем эта РНК будет экспортирована из ядра и транслирована в белок. Сплайсинг РНК соединяет друг с другом различные части кодирующей белок последовательности и наделяет высшие эукариоты способностью синтезировать несколько различных белков с одного и того же гена.

Искусный механизм сопрягает все вышеназванные этапы процессинга РНК с элонгацией транскрипции. Как было упомянуто ранее, ключевой шаг в инициации транскрипции РНК-полимеразой II — фосфорилирование хвоста РНК-полимеразы II, названного CTD (С-концевой домен). Это фосфорилирование осуществляется постепенно, по мере того как РНК-полимераза начинает транскрипцию и продвигается по ДНК. Оно не только помогает РНК-полимеразе II отделиться отдругих белков, находящихся в точке начала транскрипции, но также и позволяет новому набору белков связываться с хвостом РНК-полимеразы, чтобы выполнить свои функции во время элонгации транскрипции и созревания РНК. Как будет сказано далее, некоторые из таких белков процессинга, кажется, «перепрыгивают» с хвоста полимеразы на появляющуюся молекулу РНК, чтобы начать ее «обработку», как только она появится из РНК-полимеразы. Таким образом, мы можем рассматривать РНК-полимеразу II, работающую в режиме элонгации, как фабрику РНК, которая и транскрибирует

Рис.6.23.РНК-полимеразаIIэукариоткак«фабрикаРНК».

ПосколькуполимеразатранскрибируетДНКвРНК,онане- сетнасвоемхвостебелкипроцессингапре-мРНК,которые переносятся в надлежащее время на появляющуюся РНК. Хвост,известныйкакCTD,содержит52тандемныхповтора 7 аминокислотнойпоследовательности(52гептаповтора); вкаждомизповторовестьдвасерина.Белки,кэпирующие РНК,сначаласвязываютсясхвостомРНК-полимеразы,когда онафосфорилируетсяпосерину5гептаповторанапоздней стадии процесса инициации транскрипции (см. рис. 6.16). Эта стратегия гарантирует эффективность кэпирования 5'- конца молекулы РНК, выходящей из РНК-полимеразы. По мере того как полимераза продолжает транскрибировать, ее хвост интенсивно фосфорилируется в позициях серина 2киназой,связаннойспребывающейврежимеэлонгации полимеразой, и в конечном счете дефосфорилируется в позициях серина 5. Эти более поздние модификации привлекаюткдвижущейсяполимеразебелки,осуществляющие сплайсинг и процессинг 3'-конца РНК, а размещаются они так,чтобывоздействоватьнановосинтезированнуюРНК— как только она появится из РНК-полимеразы. Существует много ферментов процессинга РНК, и не все они «сопутствуют»полимеразе.ПрисплайсингеРНК,например,хвост несет только несколько важнейших компонентов; будучи перенесенными на молекулу РНК, они служат очагом зародышеобразованиядляостальныхкомпонентов.

Когда РНК-полимераза II завершает транскрипцию гена, онаосвобождаетсяотДНК,растворимыефосфатазыудаляютсеехвостафосфаты,ионаможетснованачатьтранскрипцию.НачатьсинтезРНКнапромотореможеттолько дефосфорилированнаяформаРНК-полимеразыII.

Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 533

ДНК в РНК, и процессирует РНК, которую производит (рис. 6.23). Полностью вытянутый CTD почти в 10 раз длиннее, чем остальная часть РНК-полимеразы, и, по сути, он служит привязью, удерживающей поблизости «свору» разношерстных белков, пока они не будут пущены в дело. Такая стратегия — увеличения скорости последовательных реакций — часто наблюдается в клетке (см. рис. 4.69 и 16.38).

6.1.11.  Первая модификация пре-мРНК эукариот — кэпирование РНК

Как только РНК-полимераза II произвела приблизительно 25 нуклеотидов РНК, 5′-конец новой молекулы РНК модифицируется путем присоединения кэпструктуры, которая представляет собой модифицированный нуклеотид гуанина (см. рис. 6.22, б). Реакцию кэпирования выполняют три фермента, действующие последовательно один за другим: один (фосфатаза) удаляет фосфат с 5′-конца новосинтезированной РНК, другой (гуанилтрансфераза) присоединяет к нему GMP через связь 5′–5′ вместо обычной 5′–3′ и третий (метилтрансфераза) присоединяет метильную группу к этому гуанозину (рис. 6.24). Поскольку все три фермента связаны с хвостом РНК-полимеразы, фосфорилированным в позиции серина 5 (модификация, осуществленная фактором TFIIH во время инициации транскрипции), то они готовы модифицировать 5′-конец транскрипта, как только он появляется из полимеразы.

5′-метил-кэп помечает 5′-конец молекул мРНК эукариот, и этот ориентир помогает клетке отличать молекулы мРНК от молекул РНК других типов, находящихся в клетке. Например, РНК-транскрипты РНК-полимераз I и III «не увенчаны» кэпструктурами отчасти потому, что этим полимеразам недостает CTD. В ядре кэп связан с белковым комплексом, называемым CBP (cap-binding protein; кэп-связывающий комплекс), который, как мы обсудим в последующих пунктах, обеспечивает должный процессинг и надлежащий экспорт РНК. 5′-метил-кэп играет важную роль также и при трансляции молекул мРНК в цитозоле, о чем мы поговорим ближе к концу этой главы.

6.1.12.  В ходе сплайсинга из недавно

транскрибированной пре мРНК удаляются последовательности интронов

Как сообщалось в главе 4, кодирующие белок последовательности генов эукариот обычно прерываются вклинивающимися между ними не-

Рис. 6.24. Реакции, которые приводят к образованию кэпструктуры на 5'-конце каждой молекулы РНК, синтезируе-

мойРНК-полимеразойII.Всвоейокончательнойформекэп содержит новую 5'–5' связь между положительно заряженным остатком 7-метилG и 5'-концом РНК-транскрипта (см. рис. 6.22, б). Буква N обозначает любой из четырех рибонуклеотидов, хотя нуклеотид, с которого начинается цепь РНК, обычно представлен пурином (А или G). (Составлено на основании A. J. Shatkin, BioEssays 7: 275–277, 1987. С лю-

безногоразрешенияICSUPress.)

534 Часть 2. Основные генетические механизмы

кодирующими последовательностями (интронами). Открытая в 1977 г., эта особенность генов эукариот вызвала удивление у ученых, которые до того времени были знакомы лишь с бактериальными генами, обычно состоящими из непрерывного участка кодирующей ДНК, непосредственно транскрибируемого в мРНК. В отличие от них, гены эукариот, как было обнаружено, разбиты на маленькие части кодирующей последовательности — экспрессируемые последовательности, или

экзоны (exons), — прерываемые намного более длинными последовательностямивставками, или интронами (introns); таким образом, кодирующая часть гена эукариот часто составляет лишь малую долю полной длины гена (рис. 6.25).

Рис.6.25.Структурадвухгеновчеловека,показывающаявзаимноерасположениеэкзоновиинтронов.

а)Относительномаленькийгенβ-глобина,которыйкодируетоднуизсубъединицпереносящегокислород белка гемоглобина, содержит 3 экзона (см. также рис. 4.7). б) Намного более крупный ген Фактора VIII содержит26экзонов;онкодируетбелок(ФакторVIII),которыйиграетважнуюрольвпроцессесвертываниякрови.Самаяраспространеннаяформагемофилииобусловленамутациямивэтомгене.

В РНК транскрибируются и последовательности интронов, и последовательности экзонов. Последовательности интронов удаляются из новосинтезированной РНК в ходе процесса «сращивания», или сплайсинга, РНК (RNA splicing). По боль-

шей части сплайсинг РНК, происходящий в клетках, направлен на производство мРНК, и наше обсуждение этого процесса сосредоточено на этом так называемом сплайсинге молекулы мРНК-предшественника (или пре-мРНК). Только после процессинга 5′- и 3′-концов и сплайсинга такую РНК можно назвать мРНК.

В ходе каждого события сплайсинга удаляется один интрон, проходя через две последовательные реакции переноса фосфорильной группы, известные под названием реакции трансэтерификации; при удалении интрона два экзона соединены им наподобие «лассо» (рис. 6.26). Так как число высокоэнергетических фосфатных связей остается неизменным, эти реакции могли бы, в принципе, протекать и без гидролиза нуклеозидтрифосфата. Однако машина, которая катализирует сращивание пре-мРНК, сложна: она состоит из 5 вспомогательных молекул РНК и не менее 200 белков и гидролизует много молекул ATP за одно событие сплайсинга. Такое дополнительное усложнение системы гарантирует, что сплайсинг будет точным

536 Часть 2. Основные генетические механизмы

Сплайсинг РНК имеет еще одно преимущество, актуальное сегодня. Сплайсинг транскриптов многих генов эукариот (оценивается как 75 % генов человека) проходит не одним, а несколькими способами, что тем самым позволяет одному гену давать соответствующий набор различных белков (рис. 6.27). Вместо того чтобы быть расточительным процессом, каковым он мог показаться на первый взгляд, сплайсинг РНК позволяет эукариотам приумножать и без того огромный кодирующий потенциал своих геномов. К этой идее мы будем снова возвращаться в этой главе и в следующей, но сначала нам нужно описать клеточные машины, которые выполняют эту фантастическую задачу.

Рис.6.27.Альтернативныйсплайсиннггенаα-тропомиозинакрысы.α-тропомиозинпредставляетсо-

бойсуперспирализованныйбелок(см.рис.3.9),которыйрегулируетсокращениевмышечныхклетках. Первичный транскрипт может быть сплайсирован различными способами, как показано на рисунке, и дать разные молекулы мРНК, которые затем приведут к разным вариантам белка. Некоторые схемы сплайсингаявляютсяспецифическимидляопределенныхтиповклеток.Например,α-тропомиозин,син- тезируемыйвпоперечнополосатоймышечнойткани,отличаетсяоттого,которыйсинтезируетсястогоже генавгладкоймускулатуре.Краснымистрелкамивверхнейчастирисункаотмеченытеучастки,гдепро- исходитрасщеплениеиприсоединениеполи-Асформированием3'-концовзрелыхмолекулмРНК.

6.1.13.  Последовательности нуклеотидов сигнализируют о том, где происходит сплайсинг

Механизм сплайсинга пре-мРНК, представленный на рис. 6.26, подразумевает, что сплайсинговая машина должна распознавать три части молекулы РНК-предшественника: 5′-сайт сплайсинга, 3′-сайт сплайсинга и точку ветвления в последовательности интрона, которая формирует основу вырезаемого «лассо». Не удивительно, что каждый участок имеет консенсусную последовательность нуклеотидов, которая остается подобной от интрона к интрону и наделяет клетку «метками» для обозначения участка, где происходит сплайсинг (рис. 6.28). Однако такие консенсусные последовательности относительно коротки и могут характеризоваться высокой степенью изменчивости; как мы увидим вскоре, клетка использует еще дополнительную информацию, чтобы точно выбрать для каждой молекулы РНК, где должен произойти ее сплайсинг.

Высокая изменчивость консенсусных последовательностей сплайсинга бросает особый вызов ученым, пытающимся расшифровать последовательности геномов. Размеры интронов колеблются в пределах примерно от 10 нуклеотидов до более