Volume1

438 Часть 2. Основные генетические механизмы

Рис.5.31Разныеобластихромосомыреплицируютсявраз-

ныепериодыS-фазы.Наэтихоптическихмикрофотографи- ях показаны окрашенные митотические хромосомы, в которыхреплицирующаясяДНКдифференциальнометилась

втечение разных заданных интервалов предшествующей S-фазы. В этих экспериментах клетки сначала выращивали

вприсутствии BrdU (аналога тимидина) и в отсутствие тимидина — с целью равномерного мечения ДНК. Затем эти клеткикратковременноинкубироваливсредестимидином

вотсутствие BrdU во время ранней, средней или поздней S-фазы.ПосколькуДНК,синтезируемаявприсутствиитими- дина, представляет собой двойную спираль с тимидином

воднойнитииBrdU—вдругой,тоонаокрашиваетсятем- нее,чемостальнаяДНК(котораяимеетBrdUвобеихнитях), видимаяввидеяркойполосы(стрелки)наэтихнегативах. Штриховые линии соединяют соответствующие позиции

на трех идентичных копиях представленной хромосомы. (СнимоклюбезнопредоставленEltonStubblefield.)

в клетках. Эти подходы основаны на использовании микрочипов ДНК — сеток размером с почтовую марку, усеянных десятками тысяч фрагментов известной последовательности ДНК. Как мы увидим подробно в главе 8, каждый отдельный фрагмент ДНК помещен в уникальную позицию на микроматрице и целые геномы могут таким образом быть представлены в четком порядке. Если образец ДНК из группы клеток, пребывающих в S-фазе, разбить на фрагменты и гибридизовать на микрочипе, представляющем геном этого организма, то может быть определено количество каждой последовательности ДНК. Поскольку фрагмент генома, который был реплицирован, будет содержать вдвое больше ДНК, чем нереплицированный участок, запуск репликационной вилки и движение вилки можно точно прослеживать таким способом (рис. 5.32). Хотя этот метод обеспечивает намного более высокую точность, полученные с его помощью результаты согласуются со многими из тех выводов, которые сделаны по итогам предшествующих исследований.

5.3.6.  Высококонденсированный хроматин реплицируется поздно, тогда как гены в менее уплотненном хроматине, как правило, реплицируются рано

По-видимому, порядок активации точек начала репликации зависит отчасти от структуры хроматина, в котором эти точки пребывают. В главе 4 мы узнали, что гетерохроматин представляет собой особенно уплотненное состояние хроматина, тогда как эухроматин упакован менее плотно, что, очевидно, необходимо для осуществления транскрипции. Гетерохроматин, как правило, реплицируется очень поздно во время S-фазы, а это предполагает, что хронометраж репликации увязан с упаковкой ДНК в хроматине. Данное предположение подтверждается анализом двух X-хромосом вклетке женской особи млекопитающего. При том что обе эти хромосомы содержат, по существу, одни и те же последовательности ДНК, одна доступна для транскрипции ДНК, а другая — не активна (обсуждается в главе 7). Почти вся неактивная X-хромосома конденсирована в гетерохроматин, и ее ДНК реплицируется во время поздней S-фазы. Ее активный гомолог менее уплотнен и реплицируется на всем протяжении S-фазы.

440 Часть 2. Основные генетические механизмы

взор на самую природу этих точек начала репликации. Ранее в этой главе мы узнали, что точки начала репликации точно определены у бактерий как специфические последовательности ДНК, которые привлекают инициаторные белки, которые затем собирают реплицирующие ДНК машины. По аналогии можно было бы ожидать, что в хромосомах эукариот точки начала репликации тоже будут представлены специфическими последовательностями ДНК.

У эукариот поиск последовательностей ДНК, которые несут всю информацию, необходимую для задания точки начала репликации, увенчался успехом при исследовании почкующихся дрожжей S. cerevisiae. Для их идентификации были изобретены действенные методы отбора, в которых используют мутантные клетки дрожжей с повреждением того или иного жизненно важного гена. Такие клетки способны выжить в селективной среде, только если будут обеспечены ДНК, которая несет функционально активную копию поврежденного гена. Если кольцевая бактериальная плазмида, содержащая этот ген, будет введена в мутантные клетки дрожжей непосредственно, то она не будет способна реплицироваться, потому что ей недостает функционально активной точки начала репликации. Однако если в такую плазмиду встраивать случайные фрагменты ДНК дрожжей, то те редко встречающиеся плазмиды, которым довелось заполучить точку начала репликации дрожжей, будут способны реплицироваться. Клетки дрожжей, которые несут в себе такие плазмиды, способны пролиферировать, потому что они снабжены значимым для жизни геном в такой форме, что его можно реплицировать и передавать клеткам потомства (рис. 5.33). Последовательность ДНК, идентифицированная по ее присутствию в плазмиде, выделенной из таких выживших клеток дрожжей,

была названа автономно реплицирующейся последовательностью (Ars). Было показано, что в большинстве своем эти последовательности являются истинными хромосомными точками начала репликации, и тем самым обоснованность стратегии, принятой для их поиска, была доказана.

Для почкующихся дрожжей было установлено местоположение каждой точки начала репликации на каждой хромосоме. Конкретная хромосома, представленная на рис. 5.34, — хромосома III дрожжей S. cerevisiae — есть одна из самых маленьких известных хромосом, с длиной менее 1/100 от длины типичной хромосомы человека. Ее главные точки начала репликации разнесены в среднем на 30 000 пар нуклеотидов; такая плотность точек должна позволить этой хромосоме реплицироваться приблизительно за 10 минут, если все они активируются одновременно. Как было упомянуто ранее, у млекопитающих точки начала репликации отстоят друг от друга значительно дальше, обычно на 100 000–250 000 пар нуклеотидов.

В ходе генетических экспериментов над S. cerevisiae были проверены последствия удаления различных точек начала репликации на хромосоме III. Удаление нескольких из них оказывает небольшое воздействие, потому что репликационные вилки, которые начинают свой путь в соседних точках начала репликации, могут продолжить его в те области, которым недостает своих собственных начальных точек. Однако удаление большего числа точек начала репликации ведет к потере хромосомы при делении клеток, потому что в таком случае она реплицируется слишком медленно. Многие эукариоты несут избыточное число точек начала репликации, возможно, чтобы гарантировать своевременную репликацию полного генома, даже если некоторые точки начала репликации не справятся со своей задачей.

442 Часть 2. Основные генетические механизмы

на рис. 5.33. Было установлено, что любая последовательность ДНК, которая может служить точкой начала репликации, содержит: 1) участок связывания крупного, многосубъединичного инициаторного белка, названного ORC (origin recognition complex), что означает комплекс узнавания точки начала репликации, 2) отрезок ДНК, обогащенный нуклеотидами А и T (и поэтому легко расплетаемый), и 3) по крайней мере один участок связывания белков, которые способствуют привлечению ORC к точке начала репликации ДНК (рис. 5.35). У бактерий, как только инициаторный белок должным образом свяжется с точкой начала репликации, сборка репликационных вилок следует более или менее автоматически. У эукариот ситуация сильно отличается из-за глубокой проблемы, связанной с реплицированием хромосом с огромным числом точек начала репликации (согласно оценке, 400 — у дрожжей и 10 000 — у человека, например). При таком числе мест, в которых можно начать репликацию, как регулируется этот процесс, причем так, чтобы гарантировать копирование всей ДНК один и только один раз?

Рис.5.35.Точканачаларепликацииудрожжей.Этапринадлежащаядрожжамточканачаларепликации (идентифицирована при помощи процедуры, обрисованной на рис. 5.33) содержит приблизительно 150 пар нуклеотидов и имеет участок связывания ORC и участок связывания Abf1 — вспомогательного белка, который облегчает прикрепление ORC. Все точки начала репликации содержат участки ORCсвязывания,новспомогательныебелкивразныхточкахначаларепликацииразличаются.Большинство точек начала репликации, подобно изображенному на этом рисунке, содержат еще и отрезок ДНК, которыйдостаточнолегкорасплетается.

Ответ заключается в самом способе, которым комплекс ORC, будучи связан с точкой начала репликации, последовательно активируется и дезактивируется. Эту тему мы обсудим подробно в главе 17, когда будем рассматривать клеточные машины, лежащие в основе цикла деления клетки. Взаимодействие «ORC–точка начала репликации» сохраняется на протяжении всего клеточного цикла, диссоциация происходит только на короткое время — незамедлительно после репликации ДНК cамой точки начала репликации, — а ее активность регулируют другие белки, которые связываются с этим комплексом. В их числе мы видим ДНК-хеликазу и два белка-установщика хеликазы, Cdc6 и Cdt1, которые собираются на комплексе ORC – ДНК. В итоге в каждой точке начала репликации во время G1-фазы формируется пререпликационный комплекс (рис. 5.36). Переход клетки из G1- в S-фазу запускается активацией протеинкиназ (Cdk), что влечет за собою отсоединение устанавливающих хеликазу белков, активацию хеликазы, раскручивание ДНК

врайоне точки начала репликации и сборку остальных репликационных белков,

втом числе ДНК-полимераз (см. рис. 5.36).

Протеинкиназы, которые запускают репликацию ДНК, одновременно предотвращают сборку новых предрепликационных комплексов, пока следующая М-фаза не приведет полный цикл в исходное положение (подробностей ради можно обратиться к разд. 17.3). Такая стратегия обеспечивает единственный удобный момент для фор-

444 Часть 2. Основные генетические механизмы

мирования пререпликационных комплексов (G1-фаза, когда активность Cdk низка) и второй момент для их активации и последующего демонтирования (S-фаза, когда активность Cdk высока). Поскольку эти две фазы клеточного цикла взаимно исключают друг друга и наступают в предписанном порядке, каждая точка начала репликации может запускаться один и только один раз в течение цикла деления клетки.

5.3.9.  Идентификация последовательностей ДНК, определяющих запуск репликации у млекопитающих, оказалась нелегким делом

По сравнению с ситуацией у почкующихся дрожжей определение последовательностей ДНК, которые задают начальные точки репликации у прочих эукариот, далось гораздо труднее. Недавно, однако, удалось идентифицировать специфические последовательности ДНК у человека — каждая несколько тысяч пар нуклеотидов

вдлину, что достаточно для формирования точек начала репликации. Эти точки продолжают функционировать, будучи перенесены (методами рекомбинации ДНК)

виные области хромосомы, если при этом они попадают в область, где хроматин относительно разуплотнен. Одна из таких точек начала репликации принадлежит к группе генов β-глобина. При нормальном положении этого участка в геноме его функция зависит главным образом от отдаленных последовательностей ДНК (рис. 5.37). Как сказано в главе 7, такая отдаленная ДНК необходима для экспрессии всех генов в группе β-глобина, а ее влияние и на транскрипцию, и на функцию точки начала репликации может объяснять длительный период деконденсации структуры ее хроматина.

Рис. 5.37. Делеции, которые инактивируют точку начала репликации у человека. Эти две делеции встречаются по отдельности у двух индивидов, которые страдают талассемией — нарушением, обусловленнымотсутствиемэкспрессииодногоилинесколькихгеновизпредставленногонасхемекластера геновβ-глобина.УобоихделетированныхмутантовДНКвэтойобластиреплицируетсявилками,которые начинаютсявточкахначаларепликациивнекластерагеновβ-глобина.

Учеловека для запуска репликации необходим ORC, гомологичный таковому

вклетках дрожжей. Многие белки, которые участвуют в процессе инициации репликации у дрожжей, аналогичным образом играют центральные роли в этом процессе у человека. Поэтому кажется весьма вероятным, что у дрожжей и у человека механизмы запуска репликации окажутся в общих чертах схожими. Однако участки связывания белкового комплекса ORC, кажется, у человека менее специфичны, нежели у дрожжей, чем можно объяснить тот факт, что точки начала репликации

вгеноме человека очерчены менее четко. Фактически структура хроматина, а не последовательность ДНК может играть основную роль в определении точек начала репликации у млекопитающих. Таким образом, как и во многих других областях

Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 445

цитобиологии, у дрожжей механизм запуска репликации ДНК наигрывает яркий лейтмотив, ведущий свое начало от самых истоков жизни, а у человека исполняет искусную вариацию на эту извечную тему.

5.3.10.  За репликационной вилкой собираются новые нуклеосомы

Есть несколько дополнительных моментов в репликации ДНК, которые свойственны эукариотам. Как было сказано в главе 4, хромосомы эукариот состоят из примерно равных частей ДНК и белка. Поэтому удвоение хромосомы требует не только репликации ДНК, но также и синтеза и сборки новых хромосомных белков на ДНК позади каждой репликационной вилки. Хотя мы далеки от понимания этого процесса во всех тонкостях, но уже начинаем постигать, как дублируется фундаментальная единица упаковки хроматина — нуклеосома. Для создания новых нуклеосом в каждом клеточном цикле клетке требуется большое количество нового гистонового белка, приблизительно равное по массе новосинтезированной ДНК. По этой причине организмы большинства эукариот обладают множественными копиями гена каждого гистона. Клетки позвоночных, например, имеют около 20 копий наборов генов, в большинстве своем содержащих гены, которые кодируют все пять гистонов (Н1, H2A, H2B, H3 и H4).

В отличие от большинства белков, которые синтезируются непрерывно на всем протяжении интерфазы, гистоны синтезируются главным образом в S-фазу, когда уровень гистоновой мРНК возрастает примерно в пятьдесят раз (и в результате увеличенной транскрипции, и в результате уменьшенной деградации мРНК). Молекулы мРНК основных гистонов деградируют в течение нескольких минут, когда синтез ДНК останавливается в конце S-фазы. Механизм зависит от особых свойств 3′-концов этих молекул мРНК, о чем будет сказано подробнее в главе 7. И наоборот, сами гистоновые белки на удивление устойчивы и могут существовать в течение всей жизни клетки. Тесная связь между синтезом ДНК и синтезом гистонов, по-видимому, отражает механизм обратной связи, который контролирует уровень свободных гистонов, — чтобы гарантировать, что количество производимых гистонов в точности соответствует количеству новосинтезируемой ДНК.

По мере своего продвижения репликационная вилка должна так или иначе миновать родительские нуклеосомы. Проводимые in vitro опыты показывают, что аппарат репликации обладает удивительной способностью (которая пока недостаточно изучена) проходить через родительские нуклеосомы, не снимая их с ДНК. Однако, для того чтобы эффективно реплицировать хромосомы в клетке, нужны белки перестройки хроматина (о них мы говорили в главе 4), которые дестабилизируют соединение ДНК–гистон. При помощи таких комплексов репликационные вилки могут эффективно преодолевать даже области высококонденсированного гетерохроматина.

Когда репликационная вилка пробирается через хроматин, в большинстве своем старые гистоны остаются связанными с ДНК и рассредоточиваются по дочерним спиралям ДНК позади репликационной вилки. Но так как количество ДНК удвоилось, для завершения укладки ДНК в хроматин необходимо равное количество новых гистонов. Старые и новые гистоны сочетаются любопытным образом. Когда нуклеосома пересекается репликационной вилкой, гистоновый октамер, судя по всему, разбивается на тетрамер H3–H4 и два димера H2A–H2B (см. рис. 4.26). Тетрамер H3–H4 остается связанным с ДНК и распределяется случайным образом между одним и другим дочерними дуплетами, но димеры H2A–H2B высвобождаются