Volume1
.pdf
428 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 5.22. Обратимая реакция надрезания ДНК, катализируемая ферментом ДНК-топоизомеразой I
эукариот.Какпоказано,этиферментынакороткиймоментобразуютодну-единственнуюковалентную связь с ДНК; благодаря этому становится возможным свободное вращение ДНК вокруг ковалентных связейсахарофосфатногоостова,сцепленногоссинимфосфатом.
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 429
Рис. 5.23. Модель механизма действия топоизомеразы II. Как показано на схеме, связывание ATP
сдвумяATPазнымидоменамивызываетихдимеризациюиобеспечиваетпротеканиепредставленных реакций.Посколькуодинциклэтойреакцииможетпроизойтивприсутствиинегидролизуемогоаналога ATP,тогидролизATP,какдумают,необходимтолькодляперезарядкиферментавкаждомновомцикле реакции. Эта модель основана на данных структурного анализа фермента в сочетании с результатами биохимических экспериментов. (Переработано из J. M. Berger, Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 26–32, 1998. СлюбезногоразрешенияиздательстваElsevier.)
5.2.11. Репликация ДНК у эукариот и бактерий в основе своей схожа
Львиная доля наших познаний о репликации ДНК изначально получена
входе исследований, проведенных на выделенных из бактерий и бактериофагов очищенных мультиферментных системах, способных реплицировать ДНК in vitro. Развитие таких систем в 1970-е гг. во многом обязано предшествующим исследованиям по выделению мутантов из огромного разнообразия отвечающих за репликацию генов; такие мутанты использовались для идентификации и очистки соответствующих репликационных белков. Первая система репликации у млекопитающих, которая в точности реплицировала ДНК in vitro, была описана в середине 1980-х гг., а мутации в генах, кодирующих почти все компоненты репликационной системы, к настоящему времени выделены и проанализированы у дрожжей Sac- charomyces cerevisiae. В результате многое стало известно о тонких особенностях репликации ДНК у эукариот, и теперь ясно, что фундаментальные особенности репликации ДНК — геометрия репликационной вилки и использование мультиферментной белковой репликационной машины — оставались консервативными на всем протяжении долгого эволюционного процесса, который разделил бактерий и эукариот.
Врепликационных машинах эукариот больше белковых компонентов, чем
вих аналогах у бактерий, даже при том что основные функции у них одни и те же. Так, например, у эукариот белок, связывающий одноцепочечную ДНК (SSB-белок) образован из трех субъединиц, тогда как у бактерий в этом белке — только одна субъединица. Точно так же ДНК-праймаза эукариот входит в многосубъединичный фермент, который содержит также ДНК-полимеразу и называется ДНК полимеразой-α-праймазой. Этот белковый комплекс начинает каждый фрагмент Оказаки на отстающей нити с РНК-затравки и затем продолжает РНК-затравку коротким отрезком ДНК. В этой точке в игру входят две главные репликационные
430 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.5.24.Процессразделениядвухкольцевыхмоле- кулДНК,катализируемыйДНК-топоизомеразойII.
ДляраспутываниясвоейДНКклеткиприбегаютклюбымухищрениям.ВотличиеоттопоизомеразтипаI, ферменты типа II используют гидролиз ATP, а некоторыебактериальныевариантымогутсоздаватьдополнительное напряжение в ДНК. Сфера действия топоизомераз типа II в основном ограничена растущими клетками эукариот; отчасти по этой причине онисталипопулярнымимишенямиприразработке противораковыхпрепаратов.
полимеразы эукариот, δ и ε, и довершают
все фрагменты Оказаки, вместе с тем прод-
левая и лидирующую нить. Как в точности задачи синтеза опережающей и отстающей нити распределяются между этими двумя
ДНК-полимеразами, еще не понятно.
Как мы увидим в следующем пара-
графе, репликационные машины эукариот должны справляться с дополнительной трудностью — это репликация ДНК на нуклеосомах — повторяющихся структурных
единицах хромосом, о которых мы говори-
ли в главе 4. Нуклеосомы расположены на
ДНК с промежутками примерно в 200 пар
нуклеотидов, чем можно объяснить, по-
чему у эукариот новые фрагменты Ока-
заки синтезируются на отстающей нити с интервалами в 100–200 нуклеотидов, а не в 1 000–2 000 нуклеотидов, как у бак-
терий. Нуклеосомы могут также служить
барьерами, которые замедляют движение молекул ДНК-полимеразы, и это может быть причиной того, что у эукариот репликационные вилки перемещаются со ско-
ростью, составляющей приблизительно лишь одну десятую скорости бактериальных репликационных вилок.
Заключение
Репликация ДНК происходит в Y-образной структуре, получившей назва- ние репликационной вилки. Фермент самокорректирующаяся ДНК-полимераза катализирует полимеризацию нуклеотидов в направлении 5′ → 3′, копируя ма- тричную цепь ДНК с поразительной точностью. Поскольку две цепи двойной спирали ДНК антипараллельны, синтез ДНК в направлении 5′ → 3′ может происходить непрерывно только на одной из цепей репликационной вилки (на ведущей, или опережающей, цепи). На отстающей (или запаздывающей) цепи синтезируются короткие фрагменты ДНК по типу «обратных стежков». Поскольку самокорректирующаяся ДНК-полимераза не способна начинать новую
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 431
цепь, для синтеза фрагментов ДНК на отстающей цепи сначала синтезиру- ются короткие молекулы РНК-затравок, которые впоследствии вычищаются и заменяются на ДНК.
Для репликации ДНК необходима согласованная работа многих белков. К ним относятся: 1) ДНК-полимераза и ДНК-праймаза, необходимые для катализа полимеризации нуклеозидтрифосфатов; 2) ДНК-хеликазы и белки, связывающие одноцепочечную ДНК (SSB-белки), помогающие расплести спираль ДНК — чтобы она могла быть скопирована; 3) ДНК-лигаза и фермент, кото- рому «поручена» деградация РНК-затравок, — чтобы сшивать дискретно син- тезируемые фрагменты ДНК на отстающей нити; и 4) ДНК-топоизомеразы,
призванные помочь разрешить проблемы закрученности спирали и спутывания ДНК. Многие из этих белков связаны друг с другом в репликационной вилке и образуют очень эффективную «репликационную машину», через которую согласуются действия и перемещения отдельных компонентов в простран- стве.
5.3. Запуск и завершение репликации ДНК в хромосомах
Мы познакомились с тем, как набор репликационных белков быстро и точно производит две дочерние двойные спирали ДНК позади репликационной вилки. Но как все эти репликационные машины собираются с самого начала и как репликационные вилки создаются на молекуле двухцепочечной ДНК? В этом параграфе мы обсуждаем, как клетки запускают (инициируют) репликацию ДНК и как они тщательно регулируют этот процесс, чтобы гарантировать его протекание не только в надлежащих позициях на хромосоме, но также и в должные периоды жизни клетки. Мы обсуждаем также несколько специальных проблем, которые репликационным машинам приходится преодолевать в клетках эукариот. В их числе необходимость реплицировать чрезвычайно длинные молекулы ДНК в хромосомах эукариот, равно как и сложность копирования молекул ДНК, которые связаны в тесные комплексы с гистонами в нуклеосомах.
5.3.1. Синтез ДНК начинается в точках начала репликации
Как сказано ранее, двойная спираль ДНК обычно очень стабильна: две цепи ДНК накрепко сцеплены друг с другом многочисленными водородными связями, образованными между основаниями обеих цепей. Чтобы быть использованной в качестве матрицы, двойная спираль должна быть расплетена и обе цепи отделены одна от другой, с тем чтобы неспаренные основания оказались снаружи. Как мы увидим, процесс репликации ДНК начинается специальными инициаторными белками (initiator proteins), которые связываются с двухцепочечной ДНК и разделяют две нити, разрывая водородные связи между основаниями.
Позиции, в которых спираль ДНК изначально раскрывается, называют точками начала репликации (replication origin; рис. 5.25). В простых клетках наподобие бактерий или дрожжей точки начала репликации задаются последовательностями ДНК из нескольких сотен пар нуклеотидов. Эта последовательность ДНК содержит
икороткие последовательности, которые распознаются инициаторными белками,
иотрезки ДНК, которые особенно легко расплетаются. Мы видели на рис. 4.4, что пара оснований A–T скреплена меньшим числом водородных связей, чем пара оснований G–C. Поэтому ДНК, обогащенную парами оснований A–T, относитель-
432 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 5.25. При запуске репликационной вилки образуется репликацион-
ный глазок. На данной схеме представлены основные этапы инициации репликационныхвилоквточкахначала репликации. Структура, образуемая напоследнемэтапе,вкоторойобецепи родительской спирали ДНК отделены друг от друга и служат матрицами для синтеза ДНК, называется репликацион-
нымглазком.
но легко разъединить, и области ДНК, обогащенные парами A–T, обычно встречаются в точках начала репликации.
Хотяосновнойпроцессзапуска репликационной вилки, изображенный на рис. 5.25, в основе своей одинаков у бактерий и эукариот, самый способ, которым этот процесс выполняется и регулируется, отличается у этих двух групп организмов. Сначала мы рассмотрим более простой и лучше изученный пример — бактерий, а затем обратимся к более сложной ситуации, имеющей место у дрожжей, млекопитающих и прочих эукариот.
5.3.2. Хромосомы бактерий, как правило, имеют единственную точку начала репликации ДНК
Геном E. coli заключен в единственную кольцевую молекулу ДНК размером 4,6·106 пар нуклеотидов. Репликация ДНК начинается в единственной точке начала репликации, и две образовавшиеся репликационные вилки движутся (со скоростью около 500–1 000 нуклеотидов в секунду) в потивоположных направлениях, пока не встретятся — примерно посередине кольцевой хромосомы (рис. 5.26). Единственная точка, в которой E. coli может управлять репликацией ДНК, — это инициация: после того как вилки будут собраны в точке начала репликации, синтез ДНК идет с относительно постоянной скоростью до тех пор, пока репликация не будет завершена. Поэтому неудивительно, что запуск репликации ДНК тщательно регулируется. Процесс начинается, когда многочисленные копии инициаторных белков связываются с определенными участками в точке начала репликации, вклиниваются в ДНК, которая теперь обвивает их, и таким образом формируют крупный ДНК-белковый комплекс. Затем к этому комплексу присоединяется ДНКхеликаза, связанная с погрузчиком спирали; хеликаза размещается вокруг соседней
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 433
Рис. 5.26. Репликация ДНК бактериального генома. У E. coli
на удвоение своего генома размером 4,6·106 пар нуклеотидов уходит около 40 минут. Для простоты фрагменты Оказаки на отстающей нити не показаны. Что происходит, когда обе репликационные вилки сходятся друг с другом в конце цикла репликации, еще до конца не ясно, хотя операция демонтажа репликационныхмашинпредусмотренавобщемпроцессе.
одинарной нити ДНК, основания которой оказались экспонированными в ходе сборки комплекса инициаторный белок – ДНК. Установщик хеликазы похож на погрузчика зажима, с которым мы встречались выше; но у него есть дополнительная обязанность — поддерживать хеликазу в неактивной форме, пока она не будет должным образом установлена на зачаточную репликационную вилку. Будучи установлена, хеликаза начинает раскручивать
ДНК, открыв достаточно одноцепочечной ДНК для того, чтобы праймаза синтезировала РНК-затравку, которая положит начало ведущей цепи (рис. 5.27).
За этими событиями быстро следует сборка остальных белков и образование двух репликационных вилок; при этом белковые комплексы движутся
относительно точки начала репликации в противо- 
положных направлениях. Эти белковые машины продолжают синтезировать ДНК до тех пор, пока вся матрица ДНК за каждой из вилок не окажется реплицированной.
У E. coli взаимодействие инициаторного белка с точкой начала репликации тщательно регулируется, при этом инициация происходит только в том случае, если у бактерии достаточно питательных веществ для совершения полного цикла репликации. Под контролем находится не только активность инициаторного белка, но и точка начала репликации, которая только что пребывала в «периоде невозбудимости», или рефрактерном периоде (refractory period), который напрямую связан с задержкой в метилировании недавно синтезированных А-нуклеотидов. Дальше инициация репликации блокируется, пока все такие А-нуклеотиды не будут метилированы (рис. 5.28).
5.3.3. В хромосомах эукариот множество точек начала репликации
Мы познакомились с тем, как у бактерий в единственной точке начала репликации появляются две репликационные вилки, которые движутся в противоположных направлениях, удаляясь от начальной точки, пока вся ДНК в единственной кольцевой хромосоме не будет реплицирована. Бактериальный геном небольшой, и две такие репликационные вилки могут управиться с его удвоением приблизительно за 40 минут. Намного больший размер большинства хромосом эукариот требует какой-то иной стратегии — которая обеспечит их своевременную репликацию.
Метод определения общей схемы репликации хромосом эукариот разработан в начале 1960-х гг. Культуру клеток человека выращивают в течение короткого времени в присутствии 3H-тимидина, так что ДНК, синтезированная в течение это-
434 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 5.27. Белки, которые запускают репликацию ДНК у бактерий. Представленный механизм был установлен в ходе экспериментов in vitro, проведенных с использованием смесей высокоочищенных белков.ПрирепликацииДНКE.coliглавныйинициаторныйбелок,хеликазаипраймазапредставлены, соответственнобелкамиDnaA,DnaBиDnaG.Напервомэтапенесколькомолекулинициаторногобелка связываютсясоспецифическимипоследовательностямиДНКвточкеначаларепликациисобразованием компактной структуры, в которой ДНК обвита вокруг белка. Затем хеликаза вводится в игру белкомустановщиком (погрузчиком) хеликазы (белок DnaC), который ингибирует хеликазу, пока она не будет должнымобразомустановленавточкуначаларепликации.Установщикхеликазы,такимобразом,оберегает хеликазу от случайного взаимодействия с другими одноцепочечными отрезками ДНК в геноме бактерии. При содействии белка, связывающего одноцепочечную ДНК (не показан), установленная хеликаза расплетает ДНК, тем самым позволяя праймазе войти в свои права и синтезировать затравку наведущейцепиДНК.Напоследующихэтапах(непоказаны)инициируютсятридополнительныецепи ДНК,ивконечномсчетесобираютсядвеполноценныерепликационныевилки.
го периода, несет радиоактивную метку. Затем клетки бережно лизируют и ДНК штрихом наносят на поверхность предметного стекла, покрытую фотографической эмульсией. Проявление эмульсии дает картину распределения меченой ДНК мето-
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 435
Рис.5.28.УE. coli задержкаметилированияточкиначаларепликации—этопериодрефрактерности инициацииДНК.МетилированиеДНКпроисходитвпоследовательностяхGATC,11изкоторыхобнаруженывточкеначаларепликации(иохватываютприблизительно250парнуклеотидов).Вметилированном состоянии точка начала репликации связана с белком-ингибитором (Seq A, не показан), который блокируетдоступинициаторныхбелковкэтомуучасткуДНК.Вконечномсчете(спустяприблизительно 20минутпослезапускарепликации)метилированныенаполовинуточкиначаларепликацииполностью метилируютсяферментомДНК-метилазой;послеэтогобелокSeqАотделяется.
За метилирование всех имеющихся у E. coli последовательностей GATC отвечает один-единственный фермент — метилаза Dam. Задержка в метилировании после репликации последовательностей GATC у E. coli используется также системой коррекции ошибок спаривания — для распознавания недавно синтезированной нити ДНК от материнской; так что значимые для такого случая последовательности GATCрассеяныповсейхромосомеинесвязаныбелкомSeqA.
дом, известным под названием авторадиографии. Время радиоактивного мечения подбирают таким образом, чтобы обе репликационные вилки успели продвинуться по ДНК на несколько микрометров, — тогда реплицированная ДНК в световом микроскопе будет видна в виде полосок из серебряных зерен, хотя сама молекула ДНК слишком тонка, чтобы быть заметной. Таким образом, с помощью данной методики можно определить и скорость, и направление движения репликационной вилки (рис. 5.29). По скорости, с которой следы реплицируемой ДНК растут в длину с увеличением времени мечения, темпы движения репликационных вилок оценивают примерно в 50 нуклеотидов в секунду. Это приблизительно одна десятая скорости продвижения бактериальных репликационных вилок, что, быть может, отражает повышенную сложность реплицирования ДНК, плотно упакованной в хроматин.
Среднего размера хромосома человека содержит одну линейную молекулу ДНК размером приблизительно 150 миллионов пар нуклеотидов. На репликацию такой молекулы ДНК от начала до конца в единственной репликационной вилке, движущейся со скоростью 50 нуклеотидов в секунду, ушло бы 0,02 секунды на нуклеотид × 150·106 нуклеотидов = 3,0·106 секунд (приблизительно 800 часов). Поэтому, как и следовало ожидать, только что описанные авторадиографические эксперименты показывают, что по каждой хромосоме эукариот одновременно движется множество репликационных вилок.
Дальнейшие эксперименты этого типа показали следующее. 1) Точки начала репликации, как правило, активируются кластерами, названными репликационными единицами, которые могут включать в себя 20–80 точек. 2) Новые репликационные единицы, по-видимому, активируются в разные периоды клеточного цикла, пока вся ДНК не будет реплицирована (к этому моменту мы еще вернемся позже). 3) В пре-
436 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 5.29. Экспериментальное доказательство схемы, согласно которой репликационные вилки об-
разуютсяидвижутсяпохромосомамэукариот.НоваяДНК,синтезируемаявкультуреклетокчеловека, кратковременнометиласьвсредесрадиоактивнымтимидином(3H-тимидина).а)Вэтомэксперименте клетки лизировали и ДНК «растянули» на предметном стекле, которое затем покрывали фотографической эмульсией. По прошествии нескольких месяцев эмульсию проявили, и на том месте, где была нанесенарадиоактивнаяДНК,появиласьполоскагранулсеребра.Дабыоблегчитьинтерпретациюавторадиограммы,наэтомрисункепоказанатолькокоричневаяДНК;немеченаяДНКвтакихэкспериментах невидима. б) Этот эксперимент проведен так же, но дополнен дальнейшей инкубацией в среде без метки — чтобы в результате дальнейшей репликации получить дополнительную ДНК, с более низким уровнем радиоактивности. Как видно на изображении б, в парах темных следов серебряное зерно сходит на нет в противоположных направлениях, что свидетельствует о двунаправленном движении вилокотцентральнойточкиначаларепликации,гдеобразуетсярепликационныйглазок(см.рис.5.25). Репликационнаявилка,какдумают,останавливаетсятолькотогда,когдавстречаетсясрепликационной вилкой, движущейся во встречном ей направлении, или когда достигает конца хромосомы; таким вот образомвсяДНКвконечномсчетереплицируется.
делах репликационной единицы отдельные точки начала репликации разделены между собой промежутками в 30 000–250 000 пар нуклеотидов. 4) Как и у бактерий, репликационные вилки эукариот образуются парами и создают репликационный глазок, по мере того как они движутся в противоположных направлениях, удаляясь от общей начальной точки и останавливаясь только тогда, когда они столкнутся лоб в лоб с репликационной вилкой, движущейся во встречном направлении (или когда достигнут конца хромосомы). Таким вот образом на каждой хромосоме независимо друг от друга работают многочисленные репликационные вилки и при этом создают две полноценные дочерние спирали ДНК.
5.3.4. У эукариот репликация ДНК происходит только на одном этапе жизненного цикла клетки
Во время быстрого роста бактерии непрерывно реплицируют свою ДНК и могут начать новый раунд репликации еще до завершения предыдущего. В противоположность им репликация ДНК в большинстве эукариотических клеток происходит только в течение определенной фазы цикла деления клетки, названной фазой синтеза ДНК, или S-фазой (рис. 5.30). В клетке млекопитающих S-фаза обычно продолжается
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 437
Рис. 5.30. Четыре последовательных фазы стандартного клеточного цикла у эукариот. Во время G1-, S- и G2-фаз клетка не-
прерывнорастет.ВовремяМ-фазыростостанавливается,ядро делится,иклеткаделитсянадвое.РепликацияДНКограничена тойчастьюклеточногоцикла,котораяназываетсяS-фазой.G1 — промежутокмеждуМ-фазойиS-фазой;G2 —промежутокмежду S-фазойиМ-фазой.
около 8 часов; в клетках более простых эукариот, наподобие дрожжей, S-фаза может занимать не
более 40 минут. К ее окончанию каждая хромосома реплицирована с образованием двух полных копий, которые остаются соединенными одна с другой своими центромерами до начала М-фазы (М означает митоз), которая вскоре наступает. В главе 17 мы описываем систему контроля, которая управляет клеточным циклом, и объясняем, почему для входа в каждую очередную фазу этого цикла нужно, чтобы клетка успешно завершила предыдущую фазу.
В следующих пунктах мы разберем, как координируется репликация хромосомы во время S-фазы клеточного цикла.
5.3.5. Различные области одной и той же хромосомы реплицируются на разных этапах S-фазы
В клетках млекопитающих на полную репликацию ДНК в области, расположенной между двумя точками начала репликации, должно, как правило, уходить лишь около часа (учитывая скорость перемещения репликационной вилки и наибольшие расстояния, измеренные между точками начала репликации). И все же S-фаза в клетке млекопитающих обычно длится примерно 8 часов. Это подразумевает, что не все точки начала репликации активируются одновременно и что ДНК
вкаждой репликационной единице (которая, как мы упоминали ранее, содержит группу из приблизительно 20–80 точек начала репликации) реплицируется в течение только малой части всего временнóго периода S-фазы.
Случайным ли образом активируются различные репликационные единицы, или различные области генома реплицируются в заданном порядке? Один из возможных способов ответить на этот вопрос — это использовать аналог тимидина, бром-дезоксиуридин (BrdU), для мечения недавно синтезированной ДНК в синхронизированных популяциях клеток, добавляя его через короткие промежутки времени на протяжении всей S-фазы. Позже, во время М-фазы, те области митотических хромосом, которые включили BrdU в свою ДНК, могут быть идентифицированы по изменившемуся окрашиванию или в реакции с анти-BrdU-антителами. Результаты показывают, что разные области каждой хромосомы реплицируются во время S-фазы
ввоспроизводимом порядке (рис. 5.31). Более того, как и ожидали, анализ репликационных вилок, наблюдаемых на авторадиограммах ДНК (см. рис. 5.29), показал, что репликации скоординированы во времени на обширных областях хромосомы.
Теперь существуют намного более тонкие методы для того, чтобы отслеживать инициацию репликации ДНК и наблюдать движение репликационных вилок ДНК